诱导多能干细胞的iMEF饲养细胞的制备和重编程转导

1 首先，每孔用 2 毫升 0.2% 明胶溶液包被 6 孔板 2。3 将板在 37 摄氏度 4 和 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。5 接下来，将 iMEF 滴加到含有 10 毫升 7 预热人成纤维细胞培养基 8 的 15 毫升试管 6 中，然后轻轻倒置试管混合。

9 将细胞悬液以 309 G 离心 3 分钟。10 除去上清液，然后将沉淀 11 重新悬浮于 12 毫升人成纤维细胞培养基中。12 将 2 毫升细胞悬液 13 放入明胶包被的 6 孔板的每个孔中。

14 并在 37 摄氏度 15 和 5% 二氧化碳下孵育过夜。16 丢弃慢病毒感染的 17 和未感染的 PDAC 的培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。18 然后加入 500 微升胰蛋白酶以解离细胞。

19 并在 37 摄氏度 20 下用 5% 二氧化碳和 5% 氧气 21 孵育 15 分钟。22 将细胞悬液以 300 G 离心 5 分钟。23 并将沉淀重新悬浮在 1 mL PDAC 培养基中。

24 用 PDAC 培养基洗涤 iMEF 板。25 然后在 iMEF 板的 5 个孔中每孔加入 50， 000 个慢病毒感染的 PDAC 细胞 26，并如前所述孵育过夜 27。28 制备重编程培养基后，29 加入 100 微升碱性成纤维细胞生长因子 30 至 100 毫升重编程培养基。

31 第二天，用预热的重编程培养基洗涤在 iMEF 饲养层上生长的细胞两次 32。33 然后向每个孔中加入 2 毫升培养基，34 并在 37 摄氏度 35 下用 5% 二氧化碳和 3% 氧气孵育过夜。36 通过 IPSC 池 5 次后，37 观察到健壮的菌落 38 保持 ESC 样形态。

39 PDAC 、 BxPc3 、 40 H6c7 和人成纤维细胞 41 表现出不同的重编程天数 42 以形成成熟的 ESC 样形态。从 PDAC 的每次重编程中建立 44 个克隆 IPSC 系、45 个 BxPc3、H6c7、46 个和人成纤维细胞。47 所有已建立的 IPSC 细胞系 TRA-160 染色阳性 48，证实它们重编程为多能性。