首先,将解剖的小鼠组织置于含有5%FBS的冷细胞培养基中。使用锋利的解剖剪刀,切碎组织,直到获得大约五毫米的碎片。将切碎的片段转移到C管中,并加入一毫升细胞培养基。
将 C 管加载到电动设备上,并将管架板安装在 D 形管底部上。将张力臂锁定到亚克力板中,将管子固定到电机板上。要从主菜单在电动设备上设置自定义程序,请按蓝色按钮选择自定义模式。
在第一个自定义模式菜单中,按绿色按钮将向前旋转的持续时间指定为 30 秒。然后按蓝色按钮选择屏幕上的值。在第二个自定义模式菜单中,按绿色按钮将反向旋转的持续时间指定为 10 秒。
然后按蓝色按钮选择屏幕上的值。在第三个自定义模式菜单中,按红色按钮将选择循环指定为四次。然后按蓝色按钮选择屏幕上的值。
将音量tage 控制旋钮调整到 200 RPM 并启动自定义程序。接下来,在含有解剖组织的四毫升冷培养基中加入消化酶。再次,将 C 管加载到设备上并重复前面演示的自定义程序。
运行后,将装有管的设备转移到 37 摄氏度培养箱中 45 分钟。接下来,将 C 管加载到设备上,并将自定义程序设置为 50 RPM,向前旋转至 270 秒。反转至 30 秒,循环 9 次。
将EDTA添加到样品的5毫摩尔终浓度中。将自定义程序设置为 100 RPM,向前旋转至 30 秒。反向旋转至 10 秒并循环两次。
接下来,将细胞悬液通过70微米的细胞过滤器,并将滤液收集在50或15毫升的管中。将收集的细胞悬浮液在300G下在4摄氏度下离心5分钟,并弃去上清液。将沉淀重新悬浮在一毫升红细胞裂解缓冲液中,并孵育一分钟。
用9毫升冷PBS中和裂解缓冲液。再次,离心细胞并将沉淀重新悬浮在所需的缓冲液或培养基中。用电动装置和手动解离制备的细胞悬液在小鼠肺、肾和心脏组织中表现出相当的细胞活力和产量。
T细胞和树突状细胞等免疫细胞群不受分离方案的显着影响。在手动分离和设备分离之间,树突状细胞中抗原呈递标记物 MHC II 的平均荧光强度也显示分离的 T 细胞的表面标记物表达频率相似。