体外人多能干细胞分化为产生胰岛素的胰腺细胞

细胞传代前。用冷包衣溶液涂覆六孔板，用5%二氧化碳在37摄氏度下孵育一小时，从含有人多能干细胞的六孔板中吸出干细胞培养基，并在每个孔中加入一毫升无钙镁DPBS。第二次洗涤后，向每个孔中加入 500 微升解离溶液，并在室温下孵育 2 至 5 分钟。

同时，从六孔板中吸出包衣溶液，并在每个孔中加入一毫升无钙镁DPBS。在倒置显微镜下，观察细胞解离过程。当80%至90%的细胞看起来是圆形的和粘附的时，从六孔板的孔中吸出解离溶液。

然后向六孔板中加入一毫升含有10微摩尔岩石抑制剂的干细胞培养基。将 10 μL 解离的细胞悬液加入试管中。然后，加入等量的台盼蓝。

轻轻混合并使用血细胞计数器计数细胞。细胞计数后，每孔加入2毫升干细胞培养基，每孔含有0.8至1乘以10至第6个细胞和10微摩尔岩石抑制剂。快速来回移动板，左右移动三次。

将板放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中。在孵育两个小时之前，快速来回移动板并左右移动 10 次。在第 0 天和第 4 天解冻基础培养基，并在冰上补充。

每天在37摄氏度的水浴中加热两毫升，一个中等，一个洗涤中一个，加热五分钟。接下来，从六孔板的孔中抽出干细胞培养基，并加入两毫升洗涤培养基。吸出洗涤介质一后，立即在孔边加入两毫升第一天培养基。

将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 24 小时。在分化过程的第 12 天，用 2 毫升抗粘性冲洗液处理含有 400 微米微孔的六孔板。在倒置显微镜下，观察板上的气泡。

如果没有观察到气泡，请吸入抗粘性漂洗液，并立即加入两毫升洗涤介质二。然后，吸出胰腺祖细胞培养基，每孔加入0.5毫升解离缓冲液。将细胞在室温下孵育两到五分钟。

当大多数细胞呈圆形且仍然贴壁时，吸出解离缓冲液并立即向每个孔中加入一毫升温簇培养基。使用P1000移液器吸头，轻轻解离细胞，上下移液，同时交替使用圆周运动，从孔的顶部移动到底部，以在整个孔中均匀分离细胞。将解离的细胞混合物转移到50毫升锥形管中。

将一毫升簇培养基加入六孔板中以收集所有剩余的细胞。接下来，从微孔六孔板中抽吸洗涤介质二，并加入解离的细胞悬浮液。将细胞在 37 摄氏度下孵育 24 小时。

第二天，使用P1000移液器吸头，将微孔六孔板中的团簇缓慢收集到50毫升锥形管中。加入 1 毫升第 13 天培养基以收集剩余的簇并将簇转移到试管中。让细胞在重力作用下自然凝固到试管底部五分钟。

小心地从试管中吸出上清液，而不会干扰细胞簇。然后，将两毫升第 13 天培养基加入试管中。通过上下移液轻轻混合，避免吸入团簇。

将悬浮液转移到粘附度非常低的六孔板上。快速来回移动板，左右移动六次。将细胞在 37 摄氏度下孵育 48 小时。

簇的免疫荧光图像显示共表达胰腺β细胞标志物的胰岛素生成细胞占主导地位。β细胞特征基因的表达显示约25%的细胞表达Nkx6.1和40%的表达Pdx1。在葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定过程中，与低葡萄糖浓度相比，MEL1衍生的簇在高葡萄糖浓度下分泌的胰岛素水平明显更高。