电镀完整的患者来源的类器官并设置用于多重活细胞成像的成像参数

首先，取一根装有患者来源的类器官或PDO悬浮液的试管，加入等量的基底膜提取物或BME。使用 20 微升移液管，将 5 微升圆顶接种到预热的 96 孔板的每个孔的中心。播种所有孔后，将盖子放在盘子上并轻轻倒置。

将倒置的板在37摄氏度下在组织培养箱中孵育20分钟，以使圆顶凝固。将盘子翻转过来，使盖子朝上。然后再次孵育。

将荧光染料和药物添加到含有PDO的平板中后。将盘子放在引文五中。启动 Gen5 软件，在任务管理器窗口中，选择成像器手动模式，然后单击立即捕获。

在设置中，指定物镜、滤光片、微孔板规格和容器类型，选择使用盖并使用较慢的载体速度，然后单击确定。然后选择感兴趣的井。选择明场通道，点击自动曝光并根据需要调整设置。

接下来要设置 Z 堆栈，请展开成像模式选项卡，选择 Z 堆栈，然后使用航向调整箭头调整焦距，直到所有 PDO 都失焦。将此点确定为 Z 堆栈的底部，然后反向重复以设置顶部。之后，通过打开编辑成像步骤来设置荧光通道。

在通道下，选择所需的通道数，为明场指定一个通道，为每个荧光通道指定其他通道。单击“确定”关闭窗口，将下拉菜单更改为 GFP 以设置第一个荧光通道的曝光，单击“自动曝光”并调整曝光选项卡下的曝光设置以减少背景信号。若要将曝光设置复制到图像模式选项卡，请单击复制图标，然后单击“编辑成像步骤”以打开一个新窗口。

在GFP通道中，单击曝光线中的剪贴板图标，为通道添加照明、积分时间和相机增益的设置。现在单击相机图标，然后在添加处理步骤下选择图像预处理。在明场选项卡上，取消选中应用图像预处理选项。

对于每个荧光通道选项卡，请确保选中应用图像预处理。取消选择，使用与通道 1 相同的选项，然后单击确定关闭窗口。现在单击添加处理步骤下的 Z 投影，根据需要调整切片范围，然后单击确定关闭窗口。

要设置动力学成像协议，请在工具栏中单击图像集，然后从下拉菜单中选择从此图像集中创建实验。单击另一个标题下的选项，然后选中不连续动力学程序框。在“估计的总时间”下，输入实验的运行时间。

单击“确定”关闭窗口。此外，此时设置板布局和温度梯度。通过单击窗口来验证数据缩减步骤。

然后导航到文件，然后单击工具栏中的保存协议。选择保存位置。输入文件名，然后单击保存。

要开始动力学成像，请将协议加载到 bio spa on demand 调度软件中，然后选择一个可用的插槽。在“过程信息”选项卡中，从菜单中选择用户。在协议槽旁边，单击选择，然后选择添加新条目。

现在，单击协议插槽旁边的选择。单击“打开”以导航并将协议导入调度软件。输入印版所需的成像时间，然后单击确定关闭窗口。

在间隔下，输入所需的成像频率，选择时间表、孔板或容器以启动孔板验证序列，单击“是”接受此时间表。