用于癌症诊断的纳米传感器表征和 CRISPR-Cas 介导的尿液生物标志物测试

首先，溶解两毫克多价PEG，马来酰亚胺反应性基团，以及一毫升100毫摩尔磷酸盐缓冲液。通过0.2微米过滤器过滤溶液。将半胱氨酸终止的DNA肽偶联物加入溶液中。

使用尺寸排阻色谱法除去未偶联的材料。在 PBS 中运行示例。监测吸光度以检测DNA和肽。

将样品放入离心过滤管中，并根据制造商推荐的速度通过离心浓缩合成的纳米传感器。使用 96 孔板作为定制壳室的基础。要收集尿液进行基线测量，首先将鼠标放入壳室中。

轻轻按压被束缚的小鼠膀胱，将剩余的尿液排出到平板上。将收集的尿液移液到1.5毫升的试管中。在无菌PBS中制备200微升纳米传感器注射液。

静脉内注射200微升溶液到每只小鼠中。注射一小时后，从对照和实验小鼠收集尿液样本。对于DNA条形码的基于荧光的CRISPR检测，在室温下以800G离心尿液样品五分钟。

现在混合CRISPR试剂，然后加入Cas12a酶，然后轻轻地上下移液反应混合物。将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后使用基于 FRET 的报告基因 DNA 混合物运行报告基因反应。

将混合物加入 384 孔板中，每两分钟立即测量 37 摄氏度的荧光，持续 3 小时，以监测裂解动力学。为了进行基于纸张的 CRISPR 检测，在 CRISPR 反应孵育后，使用 FAM-Biotin 标记的 DNA 报告基因运行替代报告基因反应。将试剂混合到96孔板中后，用铝箔覆盖，然后将板放入37摄氏度的培养箱中30分钟。

现在将 80 微升 PBS 加入 96 孔板的新鲜孔中。将20微升报告反应混合物移液到该孔中。将侧流纸条放在每个孔中，然后等待液体到达条带的顶部。

化学修饰的单链DNA相对于未修饰的双链DNA和单链DNA表现出Cas12a的激活。未处理尿液中修饰的DNA分子在侧向层析纸条上显示出比色读数。前导样本条带表明通过尿液 DNA 触发的报告基因切割释放可检测的 FAM。