首先，从在24孔板中培养水凝胶封装细胞的孔中吸出培养基。通过将 500 μL PBS 直接移液到每个含有水凝胶的孔上冲洗水凝胶，然后轻轻吸出 PBS。使用 1， 000 微升移液管，每孔加入 500 微升固定溶液，以将球状体固定在 24 孔板中。
让固定剂在室温下浸泡凝胶 30 分钟，然后移出固定剂溶液并将其丢弃在指定的废物容器中。接下来，如前所述，用PBS冲洗水凝胶三次。如果不立即使用，则将水凝胶储存在每孔 500 微升 PBS 中，温度为 4 摄氏度，最多一周。
要在水凝胶封装的细胞中染色，首先，制备适当稀释的巢蛋白和 SOX2 一抗。从孔中吸出PBS后，向每个孔中加入50微升稀释的抗体。将细胞与抗体一起孵育 24 小时以完全染色。
然后使用1， 000微升移液管，除去染色溶液并适当丢弃废物。冲洗水凝胶三次后，在成像前将其储存在 4 摄氏度的 PBS 中长达两周，或立即成像。为了清除染色的球状体以提高成像透明度，首先从每个孔中抽吸PBS。
然后依次用每孔 500 微升 20%40% 和 80% 甲酰胺处理球状体，每次 90 分钟。最后，在成像前将水凝胶在 100% 甲酰胺中孵育 24 小时。在不同的 z 堆栈深度下对球体进行成像，从而可以在 z 堆栈内的每个位置进行细胞活力评估。
利用球体堆栈的最大投影表示每个位置内的最高光强度点，简化为一个图像。染色球体的代表性图像显示，自更新转录因子 SOX2 与细胞核中的 DAPI 共定位。相反，干细胞标记物巢蛋白存在于整个细胞中。
没有凝胶的自由漂浮球体和封装的球体之间没有区别，这可能是由于所用PEG凝胶的惰性。在清除和未清除的球体中约90微米处的光学切片的代表性图像显示，当进行清除时，与未清除的球体相比，球体核心的成像深度约为30微米。
