分析流式细胞术数据以测量布氏活锥虫中糖体的相对pH值

首先，对表达氟的布氏锥虫细胞进行流式细胞术。打开一个新布局，然后将获取的 FCS 文件拖放到布局窗口中。对于门控活细胞，选择未染色的野生型对照以打开一个窗口。

使用 YL2H 或 RL2H 通道上的直方图分析数据。在这种情况下，请使用 YL2H 直方图，因为样品是用碘化丙啶染色的。接下来，建立一个平分门来分离活细胞和死细胞，将左门标记为活细胞，将右门标记为死门。

在所有样品上应用并调整此门。通过查看数据集中多个样本上的门，确保正确绘制门。在未染色的野生型对照上，双击实时门。

将点阵图的 X 轴设置为正向散射区域，将 Y 轴设置为侧向散点区域。然后使用多边形门工具勾勒出像元群的轮廓，并将其标记为像元。通过谨慎对待碎片或垂死的细胞和聚集体在点图中的典型位置来排除它们。

将细胞门应用于所有样品的活门下方，确保它覆盖所有样品的可能细胞群。双击未染色的百搭型控件上的单元格门，查看此门内的事件。要调整点阵图，请将 X 轴设置为前向散射区域，将 Y 轴设置为前向散点高度。

识别此点图上单个细胞的对角线分布，将它们与双峰区分开来。利用多边形门工具环绕单线态事件，并将此门单线命名为单线态。对所有样品在细胞门下方应用单线态栅极，确保在包括单线态的同时排除双合态，并根据需要调整不同样品的栅极。

在未染色的野生型对照样品上，双击单线门。将点阵图的 X 轴更改为 BL1H，将 Y 轴更改为 VL2H。使用多边形门工具，绘制对角门以捕获 VL2 和 BL1 中的 Fluorine-2 荧光细胞。

将此门标记为 pHL 阳性。对所有样品在单线态栅极下方应用pHL正栅极。调整pHL门以覆盖荧光强度高于野生型对照中自发荧光细胞的细胞。

要导出统计信息，请单击表格编辑器，然后单击编辑栏，最后选择添加列。合并总未计数、pHL 阳性计数、总活频率、亲本 pHl 阳性频率、pHL 阳性中位数 VL2H 和 pHL 阳性中位数 BL1H 的列。要在表格编辑器中调整导出设置，请将“显示”设置为“文件”，将“文本”设置为“CSV”。

选择文件目标和名称，然后单击创建表。随着时间的流逝，在饥饿的响应中观察到逐渐的轻度酸化，并在90分钟内趋于稳定。如绿线所示重新引入葡萄糖后，糖体 pH 值在 30 分钟内恢复到饥饿前水平，这表明糖体 pH 值是动态的，并且可调节以响应葡萄糖。