首先,将一股温和的 Argonne 吹入含有 POPC 脂质的玻璃瓶中,同时轻轻旋转小瓶。当脂质在小瓶底部干燥成薄膜时,将其松散地盖上,然后将其转移到干燥器中。一小时后加入0.5毫升超纯去离子水,使脂膜溶解。
将溶液涡旋两分钟。接下来,浸泡两个过滤器支架和去离子水。将它们放在每个内部膜支架上。
然后将一个 100 纳米的聚碳酸酯过滤器放在两个内部膜支架之间,由挤出机外壳和固定螺母固定在一起。将设置装置放在挤出机支架中,以完成小型挤出设备的设置。接下来,将脂质水混合物装入一毫升气密注射器中。
使用摆臂夹将注射器固定到小型挤出机的一端。将第二个注射器插入迷你挤出机的另一端,确保其完全凹陷。现在将脂质水混合物从原始注射器中穿过装置进入空注射器中。
重复挤压11次后,将SUV转移到1.5毫升微量离心管中。为了组装无细胞表达方案,移液管将编码可溶性 SFGFP 的 1 至 3 个 DNA 质粒或谷氨酸受体 SFGFP、鼠 RNAse 和 SUV 溶液的变体放入小瓶中。加入超纯去离子水,使反应体积达到 20 微升。
将无细胞表达溶液转移到 96 孔锥形 V 底板中。将板在 37 摄氏度的酶标仪中孵育 4 到 5 小时。将酶标仪设置为增益为 100,激发为 485 纳米,发射为 528 纳米,运行时间为 5 小时,间隔测量为每 2 分钟读取一次。
每两分钟测量一次GFP信号,以实时监测无细胞反应。可溶性SFGFP在所有3种蛋白中均表达量最高。