用于合成细胞应用的巨型单层囊泡 （GUV） 中的无细胞反应

首先，在1.5毫升微量离心管中制备GUV外部缓冲溶液。将亚精胺，ATP，GTP，CTP，UTP，磷酸肌酸，醋酸镁，谷氨酸钾，HEPES，氢氧化钾，亚叶酸混合在一起。葡萄糖和氨基酸储备液。

加入超纯去离子水，使溶液的最终体积达到一毫升。接下来，在通风橱中，将 17.3 微升 POPC 储备溶液加入 15 毫升玻璃瓶中。为此，移液1.08微升PEO-b-PBD共聚物。

小心地将一股温和的氩气吹入玻璃瓶中，同时旋转小瓶以蒸发氯仿。然后将 1.2 毫升轻质矿物油移液到玻璃瓶中。以最大速度涡旋脂质和油 10 到 20 秒。

将玻璃瓶放入 50 摄氏度左右的烤箱中 20 分钟，然后以最大速度再涡旋 10 到 20 秒。接下来，将 270 微升 GUV 外溶液移液到 1.5 毫升微量离心管中。为此，移液器各15微升的5摩尔氯化钠和4.5摩尔氯化钾。

轻轻地吸取 300 微升脂质和油混合物，放在 GUV 外溶液的顶部。孵育后，通过移液将溶液 1 至 3、编码可溶性 sfGFP 的 DNA 质粒或谷氨酸受体 sfGFP、鼠 RNAse 和一摩尔蔗糖的变体移液到 小瓶中来组装 CFE 反应。加入超纯去离子水，使反应体积达到 20 微升。

将 600 微升脂质油混合物加入含有 20 微升反应混合物的微量离心管中。用力上下移液一分钟以乳化反应。轻轻地将内部乳液分层在管中的油层顶部。

在 4 摄氏度下以 2000 g 离心 10 分钟。接下来，小心地从微量离心管中吸取多余的油和外部溶液。轻轻地将 GUV 沉淀混合在剩余的溶液中以重新悬浮。

将 GUV 溶液转移到干净的 96 孔透明平底板上进行孵育。将密封板转移到酶标仪中，在 37 摄氏度下孵育 5 到 6 小时。孵育后，将板放在倒置共聚焦显微镜上。

聚焦在包含 GUV 的感兴趣区域，然后在 488 纳米的激发波长下捕获图像。将图像保存为 TIFF 格式。在图像处理软件中打开图像。

单击“亮度/对比度”设置面板将其打开。然后调整亮度和对比度，使荧光蛋白可见。包封在GUV中的野生型谷氨酸受体无细胞表达反应表现出优异的表达和膜定位。

PRSP-谷氨酸受体易聚集和点状物形成。可溶性sfGFP在GUVS中表达，并停留在GUV管腔中。