花生种子孵育后,在黄曲霉孢子接种后,用镊子从琼脂中取出种子块。将种子块放入装有 13 个锆陶瓷珠的标记的 7 毫升珠子瓶中。对于植物抗毒素和黄曲霉毒素的提取,根据种子大小,向微珠小瓶中加入 2 或 4 毫升甲醇水混合物,并以每秒 5.5 米的速度粉碎 45 秒。
然后以 1, 860 x g 的离心速度离心 3 分钟,并将上清液收集到新样品瓶中。对于黄曲霉毒素分析,使用玻璃棒以 90 度角切割,将聚乙烯多孔筛板插入 1.5 mL聚丙烯色谱柱中。用定制的勺子,向色谱柱中加入 50 毫克镁硅胶。
用相同的筛板盖住色谱柱,然后用玻璃棒将其向下推。将 0.5 mL 上清液加入定制填充的迷你柱中,让提取物在重力作用下排流到 4 mL 玻璃瓶中。向色谱柱中加入 1 mL 甲醇水混合物,以通过重力洗去同一样品瓶中的杂质。
从样品瓶中丢弃混合洗脱液后,向色谱柱中加入 1.2 毫升丙酮乙酰丁腈水、88% 甲酸混合物,将黄曲霉毒素馏分洗脱到干净的玻璃样品瓶中。在 45 摄氏度的加热块中,以氮气流的形式蒸发样品瓶中的溶剂。蒸发后,盖上样品瓶盖,在压碎的丁中冷却 1 分钟。
将定制的巴斯德移液器过滤器放入一次性试管中,并将它们放在冰上,以尽量减少过滤时的蒸发。将干燥残留物溶于精密量取 0.25 至 1.0 毫升甲醇水混合物中。涡旋后,将 0.2 mL 等分试样转移到过滤器中。
使用氮气加快过滤到 400 μL 自动进样器样品瓶中。将样品瓶放入 UPLC 自动进样器中,将进样体积设置为 0.1 至 3.0 μL。对于植物抗毒素,将 200 微升上清液从 7 毫升离心瓶中转移到巴斯德移液器过滤器中。
过滤后,将带有聚四氟乙烯隔膜的匹配瓶盖放在样品瓶上。对于黄曲霉毒素的分离,使用水、甲醇和乙酰腈实施梯度,并具有特定百分比的组成和运行时间。将流速设置为 0.45 mL/min,运行时间设置为 9.5 min。
在系统柱温箱中,将柱温设置为 40 °C。要定量黄曲霉毒素,请将激发波长和发射波长分别设置为 362 纳米和 440 纳米。然后使用校准曲线法和 UPCL 软件手册,进行分析以确定测试样品中的黄曲霉毒素浓度。
对于二苯乙烯类化合物的分离,使用由水、甲醇和 88% 甲酸组成的梯度,并具有特定的百分比条件和时间。将流速设置为 0.5 mL/min,运行时间设置为 12 min。使用校准曲线法,确定二苯乙烯类化合物的浓度,并将测试样品的峰面积与纯、真实的标准品进行比较。
基于 UPLC 的黄曲霉毒素定量方法可实现黄曲霉毒素 B1 的灵敏定量,每次进样的限值为 2 pg。从野生槟榔树种中收获的种子的纯化提取物显示出黄曲霉毒素的明确定量。镁硅胶色谱柱方法可有效去除黄曲霉毒素组分中的杂质,与以前的方法相比,定量效率高。
此外,该方法还有助于花生植物抗毒素的定量。