SARS-CoV-2 感染的 Vero E6 细胞上清液中 SARS-CoV-2 病毒颗粒的检测

首先将酪蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和 BSA 与 pH 值为 7 混合，以制备检测缓冲液。接下来，在测定缓冲液中制备 10% 兔免疫球蛋白 G，制成样品稀释缓冲液。准备测试所需的工作珠混合物的体积。

然后将准备好的 SARS-CoV-2 和对照上清液在 4 摄氏度下解冻 1 小时。标记并排列 8 个 1.5 mL 微量离心管，分别用于 SARS-CoV-2 和对照上清液。为了使每个上清液达到最高稀释度，将 600 μL 上清液与样品稀释缓冲液混合在适当标记的试管中，然后短暂涡旋试管以混合。

依次将 400 μL 的 one I 转移到一个稀释的上清液中，再转移到下一个稀释管中。在进行下一次稀释之前，短暂涡旋每个稀释的上清液。然后在涡旋 30 秒后取预制的工作珠混合物，向平底 384 孔微量滴定板的每个指定孔中加入 5 μL。

将 45 微升制备的上清液稀释液添加到 384 孔板中含有微球的指定孔中。密封板，并在室温下在轨道振荡器上以 650 RPM 的转速在黑暗中孵育过夜。从定轨摇床中取出微量滴定板后，将微孔板以 931 g 离心 1 分钟。

然后取下板密封剂。要固定磁珠，请将微量滴定板放在磁板分离器上 30 秒。将微量滴定板仍位于磁性分离器上，从磁铁固定的珠子中吸出上清液。

从磁分离器中取出微量滴定板后，向每个含珠孔中加入 60 μL PBST。接下来，取 5 支 1.5 mL 试管制备不同的检测混合物。将人单克隆抗 S1 抗体和靶向 SARS-CoV-2 颗粒上刺突蛋白的 FLAG 标记的单链可变片段添加到每个试管中。

每孔向洗涤的微球中加入 50 μL 适当的单链、可变片段特异性加标检测混合物。密封微量滴定板并如前所述孵育。然后离心微量滴定板。

用 60 μL PBST 洗涤珠子上多余的刺突检测试剂 3 次。接下来，制备由 PE 偶联的抗人免疫球蛋白 G 和 21 偶联抗 FLAG 抗体的亮紫组成的荧光溶液。向洗涤过的微球中加入每孔 50 微升的荧光溶液混合物，并如前所述孵育。

然后旋转微量滴定板。用 60 微升 PBST 从微球中清洗过量的荧光溶液混合物。从最后一个洗涤步骤开始，将微球悬浮在 60 微升 PBST 中。

然后在双报告流分析系统上使用所需设置分析板。在两个报告基因通道中稀释 SARS-CoV-2 感染的细胞上清液时，观察到浓度依赖性信号。5 个单链可变片段中有 3 个可以检测到稀释度低至 1 到 18 的病毒。

对于其余两个单链可变片段，可在低至 1 到 6 的稀释度中检测到病毒。