单色多重定量 PCR （MMqPCR） 数据分析，以检查端粒长度测量的可重复性

首先进行 MM QPCR 测定以进行端粒长度测量。然后打开软件并选择板设置功能。之后，从下拉菜单中选择 view or edit plate 选项。

现在突出显示板上的所有孔。单击 select floraphores。选中标有 cyber 的框，并确保未选中所有其他框。

然后点击 好 确认。在保持所有井上的突出显示的同时，找到并选中 cyber 旁边、单词 load 旁边的框，以使用 cyber 标记所有井。现在突出显示位于标准对照系列稀释液顶部或底部的三个非模板对照孔。

然后从右侧的样品类型菜单中选择 NTC。突出显示构成标准对照系列稀释的 21 个孔，然后从样品类型菜单中选择标准品。当这些孔仍处于选中状态时，单击 Technical replicate（技术重复），在 Replication size（重复大小）菜单中，选择 3。

然后选择 horizontal 并单击 apply。之后，向下滚动到稀释系列部分，并在稀释因子字段中输入 2。对于 P1 板，在起始浓度字段中输入 2 乘以 10 的负 3 次方。

然后选中减少的框并单击 使用 确认设置。对于 P2 板，在起始浓度字段中输入 3.13 乘以 10 的负 5 次方。确保选中 increasing 复选框，然后选择 apply 以完成设置。

现在从样品类型菜单中突出显示与 PCR 试纸条 A 对应的列，选择未知，然后继续选择技术重复。在 replicate size 菜单中，选择 3 并选择 horizontal （水平），然后单击 apply（应用）。单击板编辑器窗口右下角的 ok。

在出现提示时单击 yes 以确认更改。接下来，验证定量选项卡中的曲线是否适用于步骤 9 和步骤 12，并且这两个步骤之间的效率值相差不超过 10%对于 P1，选择步骤 9 并突出显示对应于标准曲线的 21 个孔。从软件窗口的右下角复制 CQ 值。

然后打开端粒数据表模板并将这些值粘贴到标准的单页列 B 中，然后将步骤 9 的斜率值输入标准单页的单元格 C 4，检查每个标准稀释一式三份的变异系数是否低于 0.1。在 CFX 上，从分析中排除任何使一组一式三份超出范围的异常值数据点。现在，确认 P1 分析文件中只有 72 个样品孔在定量选项卡中以蓝色突出显示。

然后在第 9 步中，复制软件窗口右下角的 CQ 和 SQ 值，并将它们粘贴到样品 P1 表中，从单元格 D3 开始。使用 CFX maestro，确保分析样品的所有 CQ 值都在标准曲线的最低和最高 CQ 值范围内。在 Excel 表格中，验证 NTC 中的起始浓度是否小于样品孔中 DNA 平均量的 5%。对于样品水平质量控制，检查样品 P1 和 P2 上 J 列和 K 列的标准偏差和变异系数。

验证 P1 与 P2 片中（特别是 G 列中）中的单个样品板间 CV 是否不超过 0.05。如果样品的板间 CV 高于可接受值，则从每个样品的计算中删除最多一式三份。对于板级质量控制，检查每个板上所有样品的平均板间变化是否小于 0.05。

如果样品的板间 CV 高于可接受值，则从每个样品的计算中删除最多一式三份。对于其他板水平质量控制，请检查 P1 与 P2 板的总体板间变化是否小于 0.06。