首先，将酶细胞消化试剂在 37 摄氏度下解冻 30 分钟。在 10 倍放大倍率的明场显微镜下，观察分化的三维人肠道类器官，以确保细胞健康。用 500 微升冷室回收溶液替换含有分化类器官的 24 孔板孔中的培养基。
上下移液以从基底膜中释放细胞。将细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。将试管在冰上孵育 10 分钟，每 5 分钟上下吹打一次。
将细胞悬液在 4 °C 下以 400 g 离心 3 分钟。从试管中取出上清液，而不会干扰沉淀。将沉淀重悬于 500 μL 预热的酶细胞消化试剂中，上下吹打 10 次。
将类器官置于 30 摄氏度的二氧化碳培养箱中 37 分钟。每 10 分钟，使用 P1000 移液器将整个体积移液 10 次，以帮助解离细胞。在 4 摄氏度下以 400 g 离心细胞悬液 3 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL 分化培养基中。
在冰上快速上下移液细胞 50 次，以将类器官解离成单个细胞。通过 70 微米喷嘴过滤器过滤整个体积，并将洗脱液收集在新的 1.5 mL 试管中。然后在 40 微米喷嘴过滤器上过滤通过 70 微米过滤器获得的洗脱液。
将 5 μL 0.4% 台盼蓝添加到 5 μL 细胞悬液中，并使用台盼蓝排除法对活的单细胞进行计数。用细胞培养基稀释样品，以获得每微升 1000 个细胞。从分化的回肠三维人肠道类器官中共分离出 4， 402 个单细胞，代表预期的细胞类型，包括吸收性肠上皮细胞和分泌细胞。
