首先，将含有预热酶消化试剂的 15 毫升试管放入 37 摄氏度的培养箱中直至使用。将 500 微升新鲜制备的 PBS/EDTA 分装到 24 孔板的孔中。在明场显微镜下，观察分化的三维人类肠道类器官和 transwell 的生长。
将细胞培养小室从生长培养基转移到 PBS/EDTA 溶液中。从顶端侧取出培养基，并用 100 微升 PBS/EDTA 替换，而不会干扰细胞层。丢弃 PBS/EDTA 后，从孔中取出插入物，轻轻吸干到纸巾的边缘，然后倒置在工作台上。
使用锋利的手术刀刀片，在膜的内圆周周围切割，以从插入物中取出膜。用镊子将膜转移到含有 200 μL 预热酶消化试剂的 1.5 mL试管中。将膜置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中 30 分钟。
每 10 分钟，使用 P 200 移液器移液整个体积 5 次。每 10 分钟将 1 至 2 微升细胞悬液转移到载玻片上，通过定性评估单个细胞的百分比来评估解离。解离后，将每个条件的三个重复孔合并到一个 1.5 mL 微量离心管中。
加入 400 微升含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的细胞培养分化培养基，并通过移液轻轻混合。通过 70 微米喷嘴过滤器过滤整个体积，将流出液收集在新的 1.5 mL 试管中。然后在 40 微米喷嘴过滤器上过滤通过 70 微米过滤器获得的流通液。
将 5 微升 0.4% 台盼蓝加入 5 微升细胞悬液中，并计数活的单细胞。用 WRNE 生长培养基稀释样品，以获得每微升 1， 000 个细胞。从膜细胞培养插入物上生长的分化空肠人肠道类器官中共分离出 5， 623 个单细胞。
