通过瞬时转染生产重组AAV

首先，通过在 10 个直径为 15 厘米的处理过的培养皿中加入 22 毫升补充培养基来铺HEK293T细胞。孵育板 24 小时，达到 70% 至 80% 的汇合度。对于细胞转染，通过将试剂混合在微量离心管中来制备混合物，并通过敲击进行混合。

在 50 毫升离心管中将转染混合物加入 4.56 毫升未添加的 DMEM 中，并通过敲击混合。然后，逐滴加入 1.37 毫升无菌聚乙烯亚胺溶液。通过敲击混合并在室温下孵育 10 分钟，形成 DNA 聚乙烯亚胺复合物。

将该混合物加入 231 毫升预热的补充 DMEM 中。用 22 毫升该转染混合物替换每个培养皿中的培养基，并将细胞孵育 48 小时。如果 PITR 编码荧光报告基因，则在荧光显微镜下观察转染细胞。

接下来，从每个培养皿中收集培养基。以 800G 离心 10 分钟，然后取出上清液。然后，将 10 毫升预热的 PBS 添加到板中，并使用细胞刮刀去除细胞。

将细胞悬液收集到含有细胞沉淀的离心管中。确保用 10 毫升 PBS 一次清洗五个盘子来收集所有细胞。再次离心以沉淀细胞。

对于 rAAV 提取，解冻转染的细胞沉淀并重悬于 100 毫升无菌缓冲液和移液管中，以确保均匀的悬浮液。然后，加入 12.5 毫升新鲜制备的无菌 10% 脱氧胆酸钠溶液以诱导细胞裂解并通过移液混合。加入 27 微升苯佐酶核酸酶并充分混合，直到混合物不再粘稠。

在 37 摄氏度下孵育，每 10 分钟涡旋一小时。在 25 摄氏度下以 3， 000G 离心 60 分钟。使用 0.45 微米 PVDF 注射器过滤器将上清液过滤到新的无菌容器中。