用于生物样本库的计算机辅助珊瑚精子分析和冷冻保存

从雌雄同体收集配子束和从性腺珊瑚物种收集精子后，将它们放入标记的 50 毫升试管中。将 4 微升活化精子悬液放在 Makler 计数室上。为了评估精子活力，添加活化样品的浓度。

打开珊瑚生物样本库自动数据表文件并输入用于计算机辅助精子分析评估的精子稀释因子。然后，输入精子浓度、总活力和渐进活力的计算机辅助精子分析结果。在过滤后的精子样品管上写下精子浓度，然后将试管转移到冷冻保存工作站。

打开共享珊瑚生物样本库自动数据表，然后选择 Cryopreservation 选项卡。检查精子样本管标签后，通过检查菌落 ID 来识别相应的条目，使用血清移液管，通过抽取精子样本并将其排出回同一管中来测量精子样本的体积。在 E 列中输入值，检查自动计算的第 1 列以获得所需的冷冻保护剂浓度，并在第 H 列中选择要添加的低温稀释剂体积。

启动计时器。并使用移液管滴加低温稀释剂 DMSO，同时不断温和地混合样品。在 P. 列 P.Read 列 K 中记录低温稀释剂版本的时间以确定要填充的冷冻瓶数量。

打开带无菌条形码的冷冻瓶盖，将瓶盖放在无菌表面上。使用血清移液管和等分移液器，将 1 mL 样品分装到带条形码的冻存管和加盖样品瓶中。在室温下将一个热电偶样品瓶和所有填充的样品瓶放入空的冻存架插件中。

然后，将含有 10% DMSO 的虚拟冷冻瓶放入过滤后的海水中，放入冷冻架上的空槽中。在自动数据表的 U 列中输入运行编号，并将冻存管架序列号扫描到 V 列中，将光标放在 Z 列的正确单元格中，然后扫描热电偶样品瓶，然后扫描所有冻存管。将加载和扫描的架子留作冷冻保护剂平衡的剩余部分。

用液氮填充冷冻架冷却容器，以每分钟约 20 摄氏度的速度冷却至所需的水平。在 10 分钟的冷冻保护剂平衡期之后，将热电偶探头连接到数据记录器并开始记录。轻轻地将完整的冻存架放入冷却容器中，然后盖上盖子。

在色谱柱 Q 中记录开始时间。一旦热电偶样品瓶在数据记录器上显示 80 摄氏度或更低，将低温管架插件转移到液氮浴中以淬灭样品。从架子上取下冻存管，将其转移到干燥的运输箱中，以便运输到生物样本库。在 Acropora millepora 中，与 Makler 计数室相比，固定盖玻片室载玻片显示的精子浓度计数不到一半。

使用已知浓度的市售乳胶微珠验证 Makler 计数室，在预期范围内实现了一致的计数和低变异性。在使用 20% 或 30% DMSO 作为低温稀释剂冷冻保存的样品中，解冻后精子、活动精子或逐渐运动精子的浓度未观察到显著差异。