首先，将 HEK293T 细胞接种到含有 10% FBS 的 DMEM 高葡萄糖培养基的 10 层 Cell Factory 中。将细胞置于 37 摄氏度的培养箱中，在 5% 二氧化碳补充下过夜。接下来，将 350 毫升 Opti-MEM 分装到无菌 500 毫升瓶中。
将用于转染的血浆 DNA 加入瓶中，摇匀。现在将 15 毫升 PEI 溶液加入瓶中。用力摇晃混合物 30 秒，以确保混合均匀。
将混合物在室温下孵育 15 分钟后，将其转移到 1 升瓶中。然后加入 700 毫升低葡萄糖 DMEM。从培养箱中取出 10 层 Cell Factory，并将培养基真空吸入废液容器中。
小心地将 DNA 转染混合物移液到 Cell Factory 中。然后将 Cell Factory 放回培养箱中 72 至 96 小时。三到四天后，通过 0.45 微米过滤装置过滤澄清的上清液。
将 500 毫升 DPBS 加入 Cell Factory 中进行冲洗。在 4 摄氏度下以 4， 000 g 离心 20 分钟。使用真空系统和吸液管，取出并丢弃上清液。
向沉淀中加入 20 mL AAV 裂解缓冲液并混合，使沉淀重悬于缓冲液中。在零下 80 摄氏度下储存直至纯化。现在向 AAV 溶液中加入 40%PEG 氯化钠溶液，使最终浓度达到 8%PEG。
将混合物放在低速轨道旋转器上，在 4 摄氏度下过夜。将溶液在 4， 000 g 下在 4 摄氏度下离心 30 分钟以沉淀病毒。移出上清液。
然后向沉淀中加入 5 至 10 毫升 AAV HEPES 重悬缓冲液。将悬浮液转移到 50 mL 锥形管中，以继续下游纯化。接下来，将 16 号平底针固定在 10 毫升注射器上，并将准备好的碘克沙醇梯度叠加到圆顶聚丙烯超速离心管中。
使用 22 号针头，小心地在梯度顶部添加最多 17 mL 的 AAV 溶液。用 AAV 透析缓冲液加满试管。用电动密封器密封管子。
将试管在 4 摄氏度的钛转子中以 350， 000 g 离心 2 小时。然后将它们转移到超速离心管架中。现在使用新的 18 号针头将 AAV 病毒转移到透析盒中。
将病毒注入盒中后，去除盒中的空气。将搅拌棒放入装有 AAV 透析缓冲液的烧杯中，然后将其转移到搅拌板上。然后将透析盒放入带有浮标的缓冲液中。
使用 10 毫升注射器将病毒从暗盒转移到离心过滤装置中。在 4 摄氏度下以 4， 000 g 离心 15 至 30 分钟。从过滤器单元中收集浓缩的 AAV。
然后用 300 μL AAV 透析缓冲液冲洗过滤器。最后，将冲洗液转移到浓缩的 AAV 中。发现分离的 AVV 病毒纯度大于 90%，使其适合体内使用。
