绘制小鼠 LCMV 特异性滤泡辅助性 T 细胞的早期发育图

首先，获得一只 6 至 8 周龄的 CD 45.1 阳性 SMARTA 小鼠，并在 100 微升 RPMI 培养基中静脉注射 200 微克 LCMV GP 61-77 肽。从小鼠获得脾细胞后，将它们悬浮在 2% RPMI 中，以达到每毫升 eighT 细胞的 1 倍 10 倍的细胞密度，并将装有细胞的试管置于冰上。将 50 微升细胞悬液和 150 微升染色缓冲液分配到圆底 96 孔板的每个孔中。

将 96 孔板在 4 摄氏度下以 800 G 离心 1 分钟，然后小心倒出上清液。涡旋板并向每个孔中加入 200 μL 染色缓冲液。沉淀细胞后，将其重悬并与表面抗体混合物在冰上避光孵育 30 分钟。

洗涤两次后，将细胞重悬于 200 微升染色缓冲液中，并将其转移到流式细胞仪管中。进行流式细胞术分析以检查 SMARTA CD4 阳性 T 细胞的激活状态。然后将每孔 10 个 SMARTA CD4 阳性 T 细胞接种到 24 孔板中。

在 4 摄氏度下以 800 G 离心细胞 3 分钟，然后小心去除上清液培养基。接下来，向每个孔中加入 1 毫升逆转录病毒培养基和 8 μg 聚凝胺。在 37 摄氏度下以 800 G 离心转导细胞 2 小时。

丢弃逆转录病毒培养基后，将细胞与一毫升预热的 10% RPMI 并补充白细胞介素 2 一起孵育。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中并离心。弃去上清液后，用 2% RPMI 重悬细胞，以达到每毫升细胞的 1 倍 10 至第 8 个细胞的细胞密度。

为了评估转导效率，将 50 μL 细胞悬液分装到圆底 96 孔板中。将它们与表面抗体混合物（包括 CD4、V α 2 和载体标签相关抗体）在冰上孵育。如前所述，洗涤细胞并进行流式细胞术。

然后将 6 个 CD 45.1 阳性 SMARTA CD4 阳性 T 细胞中的 10 次静脉注射到 C57BL/6 受体小鼠中，然后在第二天将 10 次注射到 LCMV Armstrong 的六个噬菌斑形成单位中。从小鼠获得脾细胞后，对其进行染色以检查所需的标记物。为了检测转录因子，将细胞与 200 μL 2% 多聚甲醛在室温下避光孵育 20 分钟。

最后，进行流式细胞术以检测早期急性 LCMV 感染阶段的因素。感染后第 3 天，发现滤泡辅助性 T 细胞和 T 辅助性 1 细胞在 MIGR1 SMARTA CD4 阳性 T 细胞中平衡分叉。在 MIGR1 BCL6 SMARTA CD4 阳性 T 细胞中观察到主要的滤泡辅助性 T 细胞定向分化和 BCL6 表达水平增强。