图像分析以获得肝细胞癌 （HCC） 中肿瘤浸润免疫细胞的预后信息

首先，获取免疫染色的 HCC 切片的图像。下载并打开 QuPath 0.4.3。exe 文件。

创建一个具有合适名称的新文件夹，用于组织 QuPath 项目。点击 创建项目 软件左上角的按钮，然后选择新创建的文件夹。然后将扫描的图像拖动到 QuPath 软件窗口中。

出现新窗口后，选择 设置图像类型 并单击 H-DAB，然后 导入.要查看导入的图像，请检查菜单左侧窗口中的列表，然后双击图像将其打开。从主菜单中选择 file 并继续将图像保存为项目。

在主菜单中选择画笔或魔杖工具以注释肿瘤区域。在不连续的肿瘤区域的情况下，分别注释每个区域。按住 Control 键的同时选择所有片段。

然后右键单击并选择 edit multiple 并选择 merge selected。然后，单击主菜单中的 automate，然后选择 show script editor。复制所需的脚本，将其粘贴到脚本编辑器中，然后单击 run。

或者，从主菜单中选择折线工具以准确绘制边界，将恶性细胞巢和相邻的非肿瘤组织分开。然后从主菜单中选择边框，选择对象，单击 annotation 并选择 expand annotations。将扩展半径设置为 500 微米，然后选择 flat 作为线帽。

激活 Remove interior 并确保激活 constrain to parent （约束到父项） 处于激活状态。现在右键单击新创建的注释。选择 edit single （编辑单个），然后选择 split （拆分）。

要正确命名带注释的区域，请右键单击左侧列表中的注释。选择设置属性，然后为内边距区域和外边距区域输入适当的名称。将剩余的肿瘤区域定义为肿瘤中心。

如前所述，将靠近外缘的 500 微米宽的瘤周区域扩展。要进行详细的像素分析，请从主菜单中选择矩形工具。然后注释一个区域，包括要区分的所有像素类型。

接下来，导航到主菜单。选择 analyze 并单击 pre-processing。然后单击 estimate stain vector（估计染色向量）。

激活视觉污点编辑器后，选择 auto 并单击 okay。将估计的染色向量命名为 H-DAB。对于像素分析，另一种方法包括使用主菜单中的矩形工具突出显示用苏木精染色的细胞核的一小部分。

接下来，访问左侧菜单并选择 image.然后双击 stain one 并选择 yes。同样，使用矩形工具注释一个小区域，显示 DAB 的阳性染色。

在此之后，从左侧菜单中选择图像，然后双击染色 2，然后单击 yes。要从主菜单中评估阳性免疫细胞的面积分数，请单击分类选项，选择像素分类，然后单击创建阈值器。之后，将分辨率设置为高，选择 DAB 通道并应用 sigma 为 0.5 的高斯预过滤器。

在 0.2 和 0.3 之间调整阈值。将高于阈值的像素定义为正，将低于阈值的像素定义为负。对于区域选择，请选择任何注释。

为分类器命名。然后点击 保存， 测量 和 确定。要记录结果，请复制左侧菜单中显示的结果并将其传输到电子表格中。

从上方的主菜单中选择 measure 作为替代方法。然后选择 show annotation measurements （显示注释测量值）。选择 Copy to clipboard （复制到剪贴板） 并将这些结果粘贴到电子表格中以获取详细记录。

最后，右键单击图像，导航到多视图，然后单击关闭查看器以关闭图像。CD117 蛋白主要在肿瘤基质和血管旁间隙的圆形细胞的细胞质膜中观察到。在肿瘤包膜和外缘和肿瘤旁血管区域也观察到 CD117 阳性细胞。

NKp46 蛋白主要观察到圆细胞的胞质膜中呈正弦状空间、肿瘤中心基质和内缘。在外缘和瘤周区域的门静脉束和基质周围的包膜中观察到 Nkp46 阳性细胞。CD1a 蛋白主要在圆形细胞的细胞质膜中观察到，在肿瘤中心和内缘区域的基质和正弦状空间中散布或聚集。

CD1a 阳性细胞存在于肿瘤旁区域的鼻窦和胆道上皮中。