首先，在 E3 缓冲液中获得麻醉的斑马鱼胚胎。选择具有所需荧光的胚胎后，在明场立体显微镜下观察它们的心跳。使用宽头移液管，最多吸取三个胚胎，并将它们转移到底部玻璃成像板上。
在立体显微镜下，使用移液管，用 1% 低熔点琼脂糖溶液替换胚胎周围的培养基。使用连接到挑逗针的塑料细锥形尖端，轻轻地将每个胚胎推到成像板的底部，并将背侧定向以面向玻璃。将胚胎安装在倒置共聚焦显微镜中。
设置延时采集参数后，采集图像。打开 Imaris 文件转换器软件，然后将文件拖放到输入区域。在 Output （输出） 菜单中，指定转换后文件的位置。
点击 设置体素大小 进行验证，然后按 全部开始 按钮开始将文件转换为 IMS 格式。启动后，让分析软件在竞技场中启动。点击 观察文件夹 打开之前转换的文件。
将文件加载到软件中后，单击 Slice （切片） 视图以滚动 z 堆栈。使用 Slice （切片） 工具栏中的滑块，在使用指针绘制所选单元格的直径后测量单元格直径。单击并拖动鼠标以绘制跨越单元核心的线段，并观察在视图区域右侧的测量工具栏中绘制的线段的长度。
要自动检测单元格，请返回 3D 视图，然后单击对象工具栏中的 Spot 图标，在 Object 列表中添加新的 Spots 对象，然后打开 Automatic Spots Creation Wizard。在 Wizard 的第一步中，选择仅分割感兴趣的区域。然后启用 Track Spots Over Time 选项来计算跟踪数据，以及 Object-Object Statistics 以允许在点之间进行比较并扩展数据范围。
单击 Wizard 窗口右下角的 next 按钮。指定一个感兴趣的区域或 ROI 区域，该区域包围了胚胎的视盖。单击并拖动其每个面上的白色小箭头以修改 ROI 的大小。
然后通过时间间隔调整将其扩展到所有录制的帧。然后选择一个源通道，并将之前获得的细胞直径测量值设置为估计的 XY 直径。启用 背景减法 选项，然后单击 下一页 .
直接在阈值下限和上限框中输入强度阈值，以确保检测到所有细胞。单击 View Area 以实时观察所有这些更改。满意后，单击 Next（下一步）以验证所选的质量阈值，然后单击 View Area（查看区域）以可视化满足这两个参数的点叠加在源通道上。
接下来，选择 Autoaggressive Motion 作为跟踪算法，以跟踪具有或多或少连续运动的单元格。观察两帧之间点的运动，以判断单元格在两个时间点之间移动的最长时间，并在 max distance 字段中输入估计数字。要设置最大间隔大小，如果帧之间的间隔小于 60 秒，请使用大小 3，对于更长的时间间隔，请增加相同的大小。
启用包含所有检测到的对象的 Fill gap，以降低检测阈值并连接轨道。然后单击 Next（下一步），让软件为所有先前生成的点自动生成轨迹。如果获得的轨迹很多或很碎，请使用 Previous 按钮返回到 Creation Wizard，并调整之前定义的最大距离。
要排除短于 3 到 8 分钟的轨道，请直接在 data 字段中输入轨道持续时间过滤器下限的值。单击 Next 验证过滤器，然后转到 Creation Wizard。从分析中手动删除皮肤巨噬细胞生成的轨迹，以专注于脑实质小胶质细胞。
使用 Track Editor，手动更正 Track 中的其他潜在错误。在视图区域的右侧，激活圆圈的 Select Mode 按钮，并高亮显示需要修改或调整的轨道。选择有问题的轨道后，使用 Connect 和 Disconnect 按钮对其进行编辑以正确表示单元格移动。
在 Track Editor 中，选择 Circle Select Mode 以删除重复的单个点。如果将小胶质细胞报告基因与其他荧光标记的实质细胞一起使用，请调整估计的 XY 直径和到新细胞群的最大距离。修改图像的源通道输入。
最后，使用 Statistic 选项卡，提取所需的跟踪统计信息。单击 Settings 按钮，然后选择用于计算之前创建的每个点对象或表面对象的统计数据。胚胎斑马鱼的大脑被完整成像，神经元相对于小胶质细胞的位置被可视化。
使用该协议获得的空间数据描述了小胶质细胞的平均速度、它们在一小时内覆盖的平均距离、它们的均值平方位移以及它们在不同时间在空间中的分布。
