小鼠卵胞浆内单精子注射 （ICSI） 和代谢评估

首先，将实验雌性小鼠放在工作平台上。腹膜内注射，第一天晚上 8：00 左右施用 7.5 国际单位的怀孕母马血清促性腺激素。48 小时后，腹膜内注射 7.5 国际单位的人绒毛膜促性腺激素。

将细胞培养皿盖分为上半部分和下半部分。在上半部分，放置 4 到 6 滴，每滴 5 微升的 PVP 用于精子放置。在下半部分加入 8 至 10 滴 5 微升的 M2 培养基，用于 ICSI 程序。

用大约 3 毫升矿物油覆盖 PVP 和 M2 培养基液滴。从安乐死的雄性小鼠中分离附睾尾部后，将其轻轻吸干在消毒的纱布上。切开附睾尾部并轻轻挤压，用镊子释放精子，将它们收集在预先平衡的人输卵管中。

在预热的人输卵管液培养基中冲洗附睾尾部。将未覆盖的试管置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳培养箱中，以实现精子获能。在注射人绒毛膜促性腺激素后的第四天，将安乐死的雌性小鼠置于解剖显微镜下。

使用 25 号针头撕开输卵管的壶腹，以释放许多卵丘卵母细胞复合物。获能后，对 100 μL 精子进行超声处理 5 秒钟，以分离头部和尾部。用工作液填充显微操作针，确保填充部分在注射针内测量 0.5 厘米。

将针头安装在显微操作器的右臂上，并通过拧紧固定帽将其固定。然后在显微操作器的左臂上安装一个平头显微操作固定移液器。将注射针和固定移液器置于显微镜的视野中。

在偏光显微镜下，确定卵母细胞内中期纺锤体的位置，以确保纺锤体装置不在注射侧。当注射针与透明带接触时，激活强度为 5 且频率为 1 的压电脉冲，在透明带中产生穿孔并允许注射针通过。使用强度为 1 和频率为 1 的压电脉冲，在质膜上形成一个小孔，确保精子头被注射到卵质中。

使用无创镊子，小心地将麻醉的假怀孕雌性小鼠的卵巢、输卵管和子宫从外出。使用注射器针头的尖端在子宫管交界处下方的子宫壁上做一个小的向上倾斜的切口，避开血管。轻轻地将输卵管插入小孔 2 到 3 毫米。

使用 ICSI 方法，小鼠受精率为 89.57%，其中 87.38% 的受精卵在 ICSI 后 24 小时内进展到 2 细胞胚胎期。观察到胚胎移植后活仔的出生率为 42.5%自然出生的小鼠和 ICSI 小鼠之间的随机血糖水平没有显着波动。然而，雄性 ICSI 小鼠始终表现出空腹血糖水平升高，表明葡萄糖稳态受损。

在葡萄糖耐量试验中，雄性 ICSI 和对照小鼠之间的血糖水平存在显着差异，而雌性小鼠没有观察到差异。在体重追踪中，与对照组相比，雄性和雌性 ICSI 小鼠均表现出超重表型。