首先，在计算机上下载并安装最新版本的斐济。下载convert_to_TIFF后。py 脚本，将脚本拖放到 Fiji 上并运行代码。
浏览到存储实验的路径。转换后的 TIFF 文件将在同一实验文件夹中创建。单击插件，然后单击 3D Suite，然后打开 3D 管理器选项。
在 3D 管理器窗口中，选中与单位体积、平均灰度值、像素边界框、标准差灰度值、像素质心和单位质心对应的复选框。勾选 排除对象 在边缘 XY 上，并排除对象在边缘 Z.然后，单击 确定.打开人 T 淋巴细胞的荧光图像。
单击 Control Shift D 以复制蛋白质通道，包括堆栈。选中 hyper stack 复选框。在 channels 框中指定适当的通道号，并相应地重命名它。
要启动 Fiji 宏记录器，请导航到插件，然后导航到宏，然后选择 记录.然后，要打开 FindFoci 插件，请依次单击插件 GDSC、FindFoci 和 FindFoci GUI。从图像下拉菜单中，选择要分析的图像。
将高斯模糊设置为 1.5，将背景方法设置为高于平均值的标准差，将背景参数设置为 9，将搜索方法设置为峰背景的分数，将搜索参数设置为 0.7，将峰方法设置为相对高于背景，将峰参数设置为 0.2，将最小大小设置为 5。将 max peaks （最大峰值） 设置为较高的数字，以包括图像中的所有焦点。要增强焦点识别，请调整靠近焦点直径的高斯模糊，并增加背景参数的值以施加更严格的阈值。
然后，减小搜索参数的值以包括远离荧光峰的区域，并减小峰参数的值以分离峰。运行 FindFoci 并复制显示在录制器窗口中的字符串。字符串包含所选参数，不包括引号。
下载nuclear_prod_q. py脚本后，将脚本拖拽到 Fiji 上，然后单击 run 执行代码。在 nucleus 通道中，输入与 DAPI 通道对应的数字。
对于 nucleus Gaussian blur（细胞核高斯模糊），输入对图像进行模糊以进行分割所需的 sigma 值。然后，输入与蛋白质通道的目标染色通道相对应的数字。在 FindFoci 参数中，粘贴表示所选参数的宏录制的字符串。
勾选 visual 复选框，然后单击 browse 以选择存储图像的目录。编译完所有框后，单击 确定 继续执行。从 ROI 管理器 3D 窗口的 ROI 列表中，选择核心通道，然后单击 live ROI 以打开。
选择属于同一核心的 ROI，然后按 merge。对于不需要的原子核，请按 Delete 键。再次单击 live ROI to on（实时 ROI）以打开，全选，并确认所有细胞核都已正确分割。
从 quantification 文件夹中，打开包含用于分析的参数记录的 TXT 文件。在浏览器中打开 Google Colab。然后，从文件中选择 Open notebook（打开笔记本），并上传最终的核蛋白指标。
ipynb 脚本。将包含每个图像字段的 CSV 文件的所有文件夹上传到 Google Drive 中的首选项文件夹中。在笔记本中，指示存储结果子文件夹的文件夹的路径，并运行所有单元格。
代码编译完成后，打开包含所有已编译数据的最终电子表格文件。
