揭示硒蛋白 O 分子相互作用的热位移测定

首先，使用热位移测定或 TSA 缓冲液制备硒蛋白溶液。将蛋白质、小分子和 SYPRO Orange 染料分配到 384 孔板的相应孔中。用光学透明封板膜盖住板，并在离心机中以 1， 000 g 的浓度短暂旋转板 1 分钟。

然后将板放入实时 PCR 仪中，对其进行编程，将样品在 20 摄氏度下保持 2 分钟，然后每分钟升高 0.5 摄氏度，最高可达 95 摄氏度。从 RT PCR 机器导出相对荧光单位或相对于温度的 RFU 的数据。使用所选软件，提取并绘制数据点，直至每条熔解曲线测得的最高强度。

热变性曲线表明，在含有镁离子的 ATP 存在下，大肠杆菌 SelO 的热稳定性增加 4 摄氏度，对于带有锰离子的 ATP，相同的温度升高 12 摄氏度。然而，与 UTP 孵育后热稳定性没有变化，表明大肠杆菌 SelO 可能不会表现出与 UTP 的可检测结合。无蛋白和无染料对照的荧光信号较低，对温度升高无响应。