首先，取一个带紧盖子的玻璃盘。在盘子里放一个棉球。在通风橱下，向棉球中加入 3 到 5 毫升乙醚。
立即用盖子盖住盘子。使用画笔从果蝇小瓶中拾取果蝇的第三龄幼虫。将一只幼虫转移到一个小的敞口容器中。
将容器放入装有乙醚的玻璃皿中，并立即将培养皿盖紧。使用解剖显微镜每 30 秒检查一次幼虫的活动能力。将麻醉的幼虫转移到玻璃显微镜载玻片上。
将幼虫浸入一滴昆虫盐水中。在解剖显微镜下。用纸巾去除大部分盐水。
将幼虫背侧向上放置以进行巨大纤维消融，或将腹侧向上放置以进行 TTMn 消融。然后慢慢地将玻璃盖玻片放到幼虫上。在盖玻片的一侧加入生理盐水。
填充载玻片和盖玻片之间的空间。对于巨纤维消融术，在解剖显微镜上检查大脑在高倍率下的位置。确保大脑水平躺着，并且可以通过角质层看到。
要移位覆盖大脑的任何脂肪组织，请使用镊子对盖玻片施加轻微的压力，然后将盖玻片从一侧移动到另一侧。将样品放在多光子显微镜载物台上。使用 GFP 滤光片在落射荧光模式下定位样品。
对于巨纤维消融，专注于感兴趣的细胞，然后切换到双光子模式。将激光设置为 870 纳米并调整检测器增益以使用 Galvano 扫描仪查看表达 GFP 的细胞，使用感兴趣的圆形区域定义消融区域。接下来，继续在软件中设置消融协议，为此，依次设置一帧采集、刺激，然后是另一帧采集。
以较低的值启动刺激激光功率并运行刺激协议。如果消融不成功并且仅漂白细胞，则以 5% 的增量或一次一个循环的数量增加激光功率，然后再次运行该方案。这样做直到看到成功的细胞消融。
成功消融细胞后，取下盖玻片。用画笔轻轻地从载玻片上捡起幼虫，然后将幼虫转移到食品瓶中。在巨纤维烧蚀样品中。
通过大脑消融侧不存在 GFP 标记的胞体来验证消融。对于 TTMn 消融幼虫。由于缺少胞体和树突，一侧 TTMn 的缺失很容易识别。
