从脂肪抽吸物中机械分离基质血管组分 （mSVF） 及其用于临床应用的纤维蛋白水凝胶生产

首先，在细胞培养罩中，将收获的脂肪抽吸物添加到 50 毫升离心管中。将脂肪抽吸物转移到无菌的 20 毫升 Luer lock 注射器中。然后将 1.4 毫米连接器连接到注射器。

现在将第二个 20 毫升 Luer 锁注射器连接到连接器的对侧。将脂肪组织从一个注射器推到另一个注射器约 30 次。然后将乳化后的脂肪转移到新鲜的 50 毫升离心管中。

以 500 G 离心脂肪 10 分钟。然后丢弃油腻的顶层。收集包含分离的基质血管层的中心纯化层，并将其转移到新鲜的 50 毫升离心管中。

现在用补充的 DMEM 填充离心管至 40 毫升标记。再次以 500 G 离心试管 5 分钟。收集所得的 mSVF 层并将其转移到新的 50 毫升离心管中。

将 100 μL 分离的基质血管部分移液到无菌 1.5 ml 试管中。为此，加入 10 微升凝血酶，然后移液 10 微升氯化钙。最后，在混合物中加入 70 微升氨甲环酸。

使用新鲜的移液器吸头，在应用前不久向试管中加入 10 微升纤维蛋白原。mSVF 水凝胶混合物聚合后，将 200 微升水凝胶移液到 12 孔板中用于分析目的。现在将 100 微升纤维蛋白水凝胶加入一个孔中作为阴性对照。

将 12 孔板在 37 摄氏度下、5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。然后向每个孔中加入 1 毫升预热的培养基。将 12 孔板再次放回培养箱中 4 小时。

向每个孔中加入 1 毫升刃天青，然后再次孵育 24 小时。将刃天青样品移液到 96 孔板中。第二天，使用细胞成像多功能酶标仪测量第一次荧光强度。

为了在第 1 天、第 3 天和第 7 天进行组织学分析，将纤维蛋白水凝胶在 0.5 毫升 4% 多聚甲醛中孵育。现在向板中加入 1% PBS 并将其储存在 4 摄氏度。进行刃天青测定以量化血管部分和水凝胶的体外细胞活力。

血管部分在第 3 天显示活力降低，而 mSVF-纤维蛋白水凝胶组合仍接近基线。到第 7 天，mSVF 的活力下降，而 mSVF-纤维蛋白水凝胶组合增加。组织学分析显示，第 3 天和第 7 天的细胞核数量没有减少。

纤维蛋白水凝胶表现出最小的降解，可见细胞簇分布均匀。