使用双光子激光消融方法研究斑马鱼幼虫骨再生的生物学

首先，将转基因幼虫包埋在玻璃底微孔培养皿中的低熔点琼脂糖中。将培养皿放在倒置显微镜的显微载物台上。将所需的消融区域定位并聚焦在视野中心。

选择 Z 堆栈设置以对 opercle 的整个宽度进行成像。消融前对感兴趣的鳃盖区域进行成像。然后，在选定的 2D 平面中绘制一个直径为 25 微米的圆形区域。

使用感兴趣区域或 ROI 工具专注于鳃盖。要进行消融术，请在没有目标的情况下将测得的消融功率施加到 450 毫瓦，持续 10 秒。将所选区域暴露给双光子激光器。

消融后，通过对与消融前使用的相同设置的相同 Z 堆栈进行成像，在结构上确认消融。使用镊子或解剖针，小心地从低熔点琼脂糖中取出幼虫。首先，去除覆盖幼虫的一层琼脂糖。

其次，去除与幼虫直接接触的琼脂糖。将幼虫放回装有纯 E3 培养基的培养皿中。在病变后 4 或 6 小时，在同一显微镜上以相同的设置使用琼脂糖包埋的幼虫对鳃盖区域重新成像。

在斐济处理图像后，用核标记量化细胞，或者通过测量面积来量化细胞，以防细胞重叠。要量化该区域，请创建一个包含巨噬细胞的面膜。使用 Image， Adjust， Threshold 工具，创建 ROI，并分析粒子。

然后，测量面积。使用合适的软件生成图表，绘制测量结果。在受精后 6 天的幼虫消融后 6 小时检测到巨噬细胞在消融的鳃盖区的显着积累。

在受精后 4 天的幼虫中，巨噬细胞的数量在病变后 4 小时增加。与未消融状态相比，病变后 4 小时巨噬细胞数量和面积增加。