原位 斑马鱼幼体和幼鱼在雌雄同体发育过程中的杂交

该协议具有重要意义，因为它允许在变质过程中测定老年斑马鱼幼体和幼鱼的基因表达。这种技术的优点是已经针对探针穿透和肾脏可视化优化了几个步骤。首先，在最后一顿饭后的傍晚，通过在交配池中添加一条雄性和一条雌性鱼来设置成年斑马鱼进行交配。

第二天，将胚胎收集在含有E3培养基的培养皿中。施肥后五天，将400微米的筛网放入2.8升的水箱中，并用2厘米的系统水填充。然后从一个培养皿中加入幼虫。

要固定幼虫，请在所需的时间点取出一罐幼虫，然后使用网和转移移液器，其尖端被切断，将幼虫转移到培养皿中。接下来，加入两毫升2%三卡因以固定幼虫。固定后，用20毫升固定溶液代替三卡因。

30分钟后，将幼虫转移到含有25毫升新鲜固定溶液的50毫升管中。然后，确保盖子是紧的，慢慢地在四摄氏度下摇晃管子两天。在第三天，用20毫升PBST替换固定溶液，然后将幼虫转移到培养皿中。

要测量幼虫，将培养皿放在解剖显微镜下的平面尺子的顶部，然后使用睫毛操纵器将每个幼虫移动到尺子上以测量其总长度。测量所有幼虫后，将几个长度相似的幼虫与PBST混合到一个5.5毫升的玻璃小瓶上。对于脱水，用四毫升100%甲醇代替玻璃瓶中的PBST，然后将小瓶在零下20摄氏度下储存两天。

对于补液，用四毫升75%甲醇和25%PBST溶液代替100%甲醇，并摇动小瓶五分钟。然后，用四毫升新鲜PBST替换甲醇和PBST溶液，并再次摇动小瓶10分钟。对于蛋白酶K消化，用两毫升蛋白酶K溶液代替PBST，并在室温下摇动小瓶30分钟。

接下来，为了漂白，将幼虫转移到六孔板中，并用三毫升新鲜漂白溶液代替PBST。在沿中胚层色素沉着完全消失后，将幼虫移回玻璃小瓶中，用四毫升PBST代替漂白溶液，然后摇动小瓶10分钟。对于预杂交，用4毫升PBST替换固定溶液，并将小瓶摇动10分钟，然后，用4毫升Hyb溶液代替PBST并岩石10分钟。

在Hyb溶液中另外孵育两次后，用四毫升Hyb +溶液代替溶液。同时将EGFP荧光素探针稀释一至100在500微升杂交加溶液中，并将小瓶和探针在70摄氏度下孵育过夜。第二天，为了杂交探针，用预热的探针替换小瓶中的Hyb +溶液，并在70摄氏度下孵育过夜。

第二天，将50毫升预热的0.2倍SSCT加入50毫升管中。然后，将100微米的细胞过滤器插入管的顶部，将幼虫从玻璃小瓶转移到细胞过滤器中，并确保幼虫浸没在缓冲液中，将小瓶在70摄氏度下孵育两个小时。孵育后，将细胞过滤器转移到含有预热0.2倍SSCT的新管中，并在70摄氏度下再次孵育两小时。

接下来，为了阻断，将幼虫转移到新的玻璃瓶中，并使其冷却到室温。然后，用4毫升67%0.2倍SSCT和33%MABT溶液代替0.2倍SSCT溶液，并在室温下摇动小瓶10分钟。接下来，用四毫升新鲜MABT替换SSCTT MABT溶液，并将小瓶在摇臂上孵育10分钟。

然后，用四毫升封闭溶液代替MABT，并在四摄氏度下孵育过夜。第二天，用抗体溶液代替封闭溶液，并在四摄氏度下孵育两天。对于抗体清洗，将幼虫转移到50毫升的管中，然后加入40毫升PBST2，并将管放在其侧面，以便在4摄氏度下孵育过夜。

在第12天，将熔岩转移到六孔板后，用三毫升染色缓冲液代替PBST2。在摇臂上孵育五分钟后，用三毫升染色溶液代替染色缓冲液。当达到所需的染色强度时，用三毫升停止溶液和岩石代替染色溶液30分钟。

然后，将幼虫转移到新的玻璃瓶中，用四毫升新鲜固定溶液代替停止溶液，并在室温下孵育一小时。对于成像，用四毫升新鲜PBST代替固定溶液。在摇杆上孵育10分钟后，将幼虫转移到六孔板中，然后用四毫升新鲜PBST替换PBST，并再次摇动板10分钟。

接下来，在PBST中加入三毫升50%甘油并岩石10分钟，然后使用解剖显微镜直接在六孔板中对幼虫进行成像。这种原位杂交方案使用中胚层发育有效地标记肾脏祖细胞和各种肾单位结构。初始的中胚层肾单位在前静脉背侧约 5.2 毫米处形成。

除了单个祖细胞外，在中胚层发育过程中还存在祖细胞簇。在较大的幼体中，背景染色可能发生在体细胞中。总体而言，除了解剖的成人器官外，这种方法还可用于研究在过程中形成的其他组织。