用 DNA 损伤剂处理小脑器官型培养物，用于 PAR 链的荧光成像以评估遗传毒性应激反应

首先，从基础培养基鹰中的 10 日龄小鼠幼崽中回收的小脑组织进行培养。将 DNA 损伤化学物质以适当的最终浓度直接添加到培养基中。暴露期后，用新鲜制备的含有 DNA 损伤化学物质和聚 ADP 核糖糖水解酶抑制剂的混合培养基更换培养基，并孵育 30 分钟。

30 分钟后，在室温下用 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液洗涤切片，并立即用预冷的丙酮和甲醇混合物固定。将板在零下 20 摄氏度下孵育 20 分钟。然后取出固定液，用 0.4 摩尔磷酸盐缓冲液洗涤。

向 48 孔板的每个孔中加入 100 微升 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液。然后用手术刀和砧板去除插入物的边缘，在组织切片周围切割。将切片放入 48 孔板的孔中。

吸出缓冲液后，将插入片段与 100 微升含有 1%Triton X100 的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液一起孵育。吸出溶液，并在摇床上用适量的封闭溶液连续孵育每个孔中的插入片段，然后用二抗中的一抗孵育一抗。在与二抗孵育 2 小时前 20 分钟，向每个孔中加入 20 μL 最终 DAPI 溶液，并继续振荡 20 分钟。

安装时，将组织放在显微镜载玻片上，组织朝上。添加封固剂并盖上盖玻片。将载玻片放在平坦的表面上，让它们在 4 摄氏度的黑暗中干燥过夜。

小脑叶在培养物中得以维持。浦肯野细胞钙结合蛋白 D-28K 染色，神经核 NeuN 染色。对浦肯野细胞中的星形胶质细胞进行 GFAP 染色。

暴露于溴酸钾和百草枯后，处理过的浦肯野细胞的 PAR 染色增加，表明 DNA 损伤。