分光光度法定量视网膜裂解物中 GPCR-11-cis 视网膜蛋白复合物

首先，将安乐死小鼠的眼球去核，并在冰冷的缓冲液中使眼睛匀浆。将匀浆在 16， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。丢弃含有水溶性蛋白质和其他污染物的上清液。

然后在旋转平台上将沉淀的膜和膜蛋白在缓冲液中重悬和溶解 1 小时。然后，将溶解的膜组分在 4 摄氏度下以 16， 000 G 离心 1 小时。将上清液与 30 至 50 μL Rho1D4 抗体珠和空白免疫球蛋白 G 抗体珠混合，放入两个单独的独立样品中，并在 4 摄氏度下在旋转平台上孵育 1 小时。

使用磁力架，通过收集磁珠来分离 pull-down。弃去上清液，用含有 Bis-tris 丙烷、氯化钠和 N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷的高盐和低盐缓冲液洗涤珠子。要洗脱视紫红质蛋白，请在室温下用给定成分的 65 μL 缓冲液孵育磁珠 5 至 10 分钟。

然后使用具有 2 毫米孔径和 10 毫米光程的矩形亚微米 50 微升石英肘，用分光光度计在快速扫描设置中分析 200 纳米至 800 纳米的洗脱液吸光度。为了验证和确定质量，请将洗脱液暴露在强光下 1 分钟。然后重复吸光度测量。

减去空白吸光度并计算分析的吸收光谱的比率。然后绘制空白减去的吸收光谱，并计算游离视蛋白值。然后，使用 Beer-Lambert 定律，计算视紫红质的浓度，然后计算无配体视蛋白的浓度，并估计载脂蛋白和无配体视蛋白的浓度差异，以及数量和百分比。