多能干细胞 （PSC） 的心脏分化和免疫荧光染色

将多能干细胞或 PSC 维持在六孔培养板中，并在显微镜下确认细胞密度。对于心肌细胞或 CM 分化，将 PSC 接种到 PSC 制备培养基中的 96 孔培养板中。在心脏分化的第一阶段，当 PSC 达到 80% 至 90% 汇合时，将培养基换成具有 2 至 20 微摩尔 CHIR 的 CM 分化培养基。

CHIR 处理 24 至 48 小时后，将培养基更换为新鲜的 CM 分化培养基。在第 2 阶段或第 3 天，用补充有 5 微摩尔 IWR1 的 CM 分化培养基替换培养基，直至第 5 天。然后将培养基更换为 CM 分化培养基，并保持至第 6 至 7 天，此时 PSC 分化为心脏祖细胞或 CPC。

在第 10 天或第 12 天，在室温下用 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞 15 分钟。染色时，在室温下用透化溶液处理细胞 30 分钟。将样品与 CTNT 一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。

然后在含有 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中用二抗在 37 摄氏度下处理样品 1 小时。从细胞中取出二抗后，在室温下用 Hoechst 对细胞核染色 5 分钟。然后使用 PBS 冲洗细胞 3 次，然后每孔加入 100 μL PBS 以避免干燥。

要使用支持活细胞培养的自动显微镜收集不同分化阶段的明场和 CTNT 免疫荧光图像，请打开软件并创建新的实验设计。选择 5X 物镜和 2X2 混合物镜进行成像。在通道菜单中，添加用于明场的 TL 明场通道和用于免疫荧光成像的 AF 488 和 H 33 42 通道。

修改成像设置中的光路。在 Z 堆栈菜单中，设置扫描时的切片数和间隔。在 navigation and tiles（导航和平铺）窗口中，按载波设置平铺区域，并将 25 个平铺 5 列设置为 5 行，用于一个井。

要获取图像，首先将细胞培养板放入样品盘中，然后将托盘装入显微镜内。如果样品由活细胞组成，请打开加热系统和二氧化碳泵，以保持 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的适当培养条件。打开预设的实验项目。

打开平铺菜单并手动校准板的位置。在导航和瓦片窗口中，选择所需的孔，然后单击 create 为这些孔构建瓦片区域。单击平铺菜单中的验证平铺区域，然后运行自动聚焦以验证所有孔。

然后手动校正每个孔的焦点。单击 start experiment 按钮并等待自动成像。通常，扫描整个 96 孔培养板大约需要 1.2 小时。

在处理框架中，选择 Image export（图像导出），选择未压缩的 TIFF 格式或 PNG 格式的文件类型，然后应用。