用DMSO对人多能干细胞的暂时性治疗促进分化

这是一种简单的治疗，可以应用于任何干细胞系或分化协议，以用于分化的素细胞。所有需要做的就是在1-2%的细胞培养维持介质中添加DMSO。该技术的主要优点是，它允许通过启动细胞进行分化，显著增加多能干细胞的分化潜力。

DMSO 治疗增加了细胞与患者衍生的 iPSC 区别的机会，从而允许它们用于细胞替代治疗、疾病建模和药物筛查。它可以导致在胚胎发育过程中控制亚增殖、分化和规范的调控的早期开始。我们已经证明，DMSO治疗改善了近50个人类胚胎和诱导多能干细胞系的分化。

而其他实验室已经表明，它有利于其他物种的干细胞，如小鼠和灵长类动物。在分化开始前一天，将 DMSO 以 1 或 2% 的浓度添加 24 小时添加到典型的维护介质中。在DMSO治疗后24小时，更换介质，继续您通常的分化方案。

根据手稿方向生长细胞。当细胞达到适当的汇合时，分离它们并准备单个细胞悬浮液。使用血细胞计或自动细胞计数器计算活细胞，使用活力标记（如 trypan Blue）。

为了在24小时DMSO预处理范围内实现80-90%的汇合，将细胞板对涂层的六井板进行，密度为每井50万至100万个细胞。在二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育细胞24小时。然后，吸气介质并将其替换为 1-2%DMSO 解决方案。

允许细胞在分化前24-28小时孵育。如果孵育48小时，24小时后用新鲜的DMSO溶液更换介质。为了实现三培养分，生长和收集细胞悬浮液中的细胞。

计算活细胞，用 ROCK 抑制剂在干细胞培养基中将它们板在未涂装的低附着六井板中。通常，3D人类多能干细胞球体将在24小时内形成。让细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育24小时。

根据手稿说明，在预热干细胞介质中准备 1-2%DMSO。要在孵化后更换介质，请将板倾斜到 30 度至 45 度角，并允许细胞球体在井底安定。从细胞中吸出介质，并在 DMSO 溶液中轻轻重新挂起它们。

让细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育24-48小时。使用 DMSO 预处理细胞，如所述的 2D 培养，并准备诺金和 SB431542 库存解决方案。准备足够的 10% 敲除血清置换， 或 KOSR， 在淘汰 DMEM 三到四天的介质变化.

准备异位分化介质，如手稿中所述，将 noggin 和 SB431542 添加到预加热的 KOSR 敲除 DMEM 中。在DMSO预处理后，从细胞中吸出介质，并在每井中加入两毫升的分化介质。允许细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育三到四天，每天用新的分化因子取代培养基。

与未处理的细胞相比，DMSO预处理导致细胞生长速率的暂时性且剂量依赖性降低。这种减少增殖与细胞对细胞接触的增加有关，这在2%的DMSO处理细胞中尤为明显。当细胞被固定和染色的每个细菌层的原型标记，可以看到，2%DMSO预处理导致分化细菌层细胞的比例增加。

例如，SOX17 被染色以可视化内端细胞。为了研究DMSO对中枢神经系统祖细胞类型分化的影响，人类诱导的多能干细胞可以分化成神经祖细胞或寡头细胞祖细胞。与对照细胞相比，2%的DMSO预处理增加了神经祖细胞标记Pax6的表达。

同样，预处理增加表达寡细胞祖细胞标记Olilig2的细胞比例。此外，初始DMSO治疗改善了人体胚胎干细胞衍生细胞功能后体内移植。当分化的胰腺祖细胞被移植到免疫缺陷小鼠中时，可以测试其功能，以应对葡萄糖挑战或KCl刺激。

移植后两周至16周的细胞功能明显改善。要考虑的最重要的考虑因素是干细胞的循环或加倍时间。DMSO 治疗的长度应与细胞的循环时间相同。

在最初的DMSO治疗之后，人们可以理解细胞增殖和细胞周期是如何在干细胞中调节的，因为这种治疗有助于促进细胞周期G1阶段的生长停止。分化细胞可用于了解疾病相关机制，与其他细胞类型共同培养，在肿瘤原性测定中，以及在功能测定或移植研究中，以确定分化细胞能否挽救疾病表型。