首先，将从绵羊收集的骨软骨外植体脱水到含有 25 毫升脱水溶液的 40 毫升玻璃瓶中。将样品瓶放在旋转轮上，在室温下放置 1 小时。最后一次洗涤后，用 25 毫升二甲苯代替脱水溶液。
将玻璃样品瓶放在旋转轮上，在室温下放置 1 小时。接下来，加入 10% 过氧化苯甲酰、10% 邻苯二甲酸二丁酯和 450 微升用丙醇稀释 1 至 20 的 N，N-二甲基苯胺，并将玻璃瓶置于零下 20 摄氏度过夜。现在，将外植体放入塑料盒中的中型包埋模具中。
将甲基丙烯酸甲酯、过氧化苯甲酰、邻苯二甲酸二丁酯、N、N-苯胺溶液倒入模具中。用氮气流使模具通风 5 分钟。密封盒并将其在 4 摄氏度下放置 48 小时以进行 MMA 聚合和硬化。
两天后，从模具中取出含有外植体的树脂。使用金刚石锯沿其长轴切割含有外植体的聚甲基丙烯酸甲酯块，以 3000 RPM 的速度以每分钟 3 毫米的速度生成 1.5 毫米厚的切片。用碳化硅纸研磨升序数字的部分。
用 10 纳米碳膜涂覆厚截面。将截面安装在铝短管上。然后，在截面顶部和短线之间创建一个银色油漆桥，以允许电子电荷排放到地面。
将存根放在扫描电子显微镜或 SEM 载物台上。关闭腔室并启动真空。打开电子束并调整 SEM 设置以在背散射电子模式下运行。
将碳的灰度标准设置为 25，铝的灰度标准设置为 225，硅的灰度标准设置为 253。用标准品校准 SEM 后，在背散射电子模式下获取样品的图像。使用样品的背散射电子图像将灰度级转换为钙含量。
然后，绘制图像的钙分布含量。将切片放在拉曼微型光谱仪的载物台上。校准波数以确保准确性，并在测量前对准激光器。
要收集拉曼光谱，请使用 30 毫瓦的 785 纳米激光器。将积分时间设置为 20 秒，重复 3 次，并使用每厘米 350 比 1， 800 的光谱范围，分级为每毫米 1， 200 行。校准纳米压痕系统后，将样品放入光学系统中并确定纳米压痕的位置。
然后，将样品移动到压痕装置下方。将压痕深度设置为 900 纳米，加载-卸载速度为每分钟 40 毫米，加载和卸载之间暂停 15 秒。将骨组织的余弦系数设置为 0.3 并开始纳米压痕。
