壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒补料用于家蚕幼虫反向基因功能研究

首先，准备壳聚糖双链 RNA 纳米颗粒，用于喂养蚕幼虫。然后挑选大小相似的新鲜蜕皮的五龄蚕幼虫进行摄食实验。将每个幼虫单独放入六孔板的孔中。

盖上板子，让幼虫饿 24 小时。接下来，用去离子水冲洗新鲜的桑叶，然后用干净的厨房纸擦干。将完全干燥的叶子切成 1 厘米 x 1 厘米的叶盘。

使用前，将壳聚糖 dsRNA 纳米颗粒以 500 ng/μL 的浓度溶解在无核酸酶的水中。将 10 微升壳聚糖 dsRNA 纳米颗粒、对照壳聚糖纳米颗粒和裸露的 dsRNA 分别涂在每个桑叶盘的表面上。让溶液在室温下在叶盘上风干 5 分钟。

接下来，每天为每个幼虫提供一个纳米颗粒包被或 dsRNA 包被的叶盘。一旦涂层的叶盘被幼虫完全吃掉，每天提供新鲜的桑叶。第六天，将幼虫放在冰上，直到它们无法移动。

要解剖幼虫，请在干净的培养皿上用剪刀剪掉胸部，然后用镊子拉出中肠。删除内容物后。在培养皿中用无核酸酶的水清洗中肠。

将中肠在零下 70 摄氏度下冷冻在 1.5 毫升的试管中。与对照处理相比，喂养家蚕中的壳聚糖 dsRNA 纳米颗粒导致 BmToll9-2 转录水平降低 79%。用 BmToll9-2 沉默壳聚糖 dsRNA 纳米颗粒处理的家蚕幼虫明显小于对照幼虫。

来自 BmToll9-2 沉默幼虫的茧也显著小于对照组的茧。