这项研究是由美国国家科学基金会职业奖（MCB - 0746066，转录激活，规范应急行为表征）RDW 我们非常感谢LJ希姆库斯，BS高盛，G.孙明扬，M.歌手，LG韦尔奇，KA的墨菲，有益的讨论和对稿件的意见和HG泰勒。

用品需要： <ul><li> Klett米</li><li>移液器和提示</li><li> 2.5毫升离心管</li><li>离心</li><li> CTTYE媒体： <ul><li> Casitone 1.0％（DIFCO实验室），0.5％的酵母提取物（DIFCO实验室）， </li><li> 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH 2 PO 4，硫酸镁 8.0毫米</li></ul></li><li> TPM的媒体： <ul><li> 10.0毫米的Tris - HCl（pH值8.0），1.0毫米的KH 2 PO 4，硫酸镁 8.0毫米</li></ul></li><li>琼脂糖</li><li>置水浴至55 ° C </li><li>显微镜幻灯片</li><li>大型盖玻片</li><li> 2 × 2厘米，0.5毫米厚的硅橡胶垫片（格雷斯生物实验室公司） </li><li>封口膜（或磁带标签） </li><li>镊子</li><li>小长尾夹</li><li>微取样吸管（费舍尔） </li><li> 100μL玻璃一次性提示（费舍尔） </li><li> Kimwipes </li></ul>第1部分：细胞制备开始创造一个无菌的环境。 <ul><li>清洁工作区，唐手套，光刻录机。 </li></ul><ol><li>开始接种到含有CTTYE肉汤瓶和大力纷飞在黑暗中32℃孵育过夜培养的细胞。 </li><li>文化一旦达到了5 × 10 8个细胞/ ml成2.5 ml离心管，吸管1毫升细胞的密度。 </li><li> 16,000 XG（或最大速度）2分钟离心沉淀细胞。 </li><li>倒出并丢弃上清液。 </li><li>洗细胞沉淀用1 ml TPM（盐平衡，营养的自由媒体）。 <ul><li>重新挂起和涡</li></ul></li><li>重新颗粒细胞为16,000 XG（或最大速度）2分钟旋转。 </li><li>倒出并丢弃上清液。 关键的一步 </li><li>完全重新悬浮颗粒在100μLTPM的使用相结合的吹打和涡旋媒体。 重要提示：此步骤可确保有没有留在管细胞团块。这可能需要一段时间。 </li><li>设置在室温下的细胞，预留而准备的跟踪检测板。 </li></ol>第2部分：琼脂的制备<ol><li>准备50毫升TPM（化验媒体）和CTTYE（营养磁盘）媒体。 </li><li>添加0.5克琼脂糖（琼脂糖低于琼脂衍射）。 </li><li>高压灭菌消毒。 </li><li>灭菌后，媒体保持在55 ° C在孵化器（或水浴），而建设的跟踪检测板配合。 </li></ol>第3部分：营养磁盘建设<ol><li>火焰灭菌的玻璃显微镜玻片上放置一个0.5毫米厚的无菌的硅橡胶垫片，形成一个小的好。 </li><li>移液器〜300μL的55 °彗星CTTYE媒体/琼脂糖到以及创建幻灯片上的垫圈和包含的营养磁盘。 CTTYE媒体/琼脂糖应土堆。 </li><li>将火焰消毒CTTYE媒体/琼脂糖上的幻灯片（无垫片）。 重要说明：这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。 </li><li>一旦幻灯片到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。 </li><li>裁剪复杂放置在4 ° C和允许CTTYE媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。 </li></ol>第4部分：跟踪检测的准备 - 设置板配合物装配组件，准备幻灯片的复合物，放置营养磁盘，倒入TPM的媒体/琼脂糖，单独和干板复合物，板细胞，并组装跟踪检测板复合物。 复杂的部件组装板<ol><li>对于每一个复杂的，火焰灭菌玻璃显微镜幻灯片</li><li>将幻灯片上的蒸压垫片和预留（消毒端升级）。这将形成检测的底部。 </li><li>火焰消毒的玻璃盖滑，并将其放置在顶部用标签胶带（或封口膜）包裹的第二个玻璃显微镜幻灯片，并预留（消毒端升级）。这是作为一个支持幻灯片，以防止开裂盖玻片。这将形成检测的顶部。 </li><li>火焰消毒第三玻璃显微镜玻片上，并预留（消毒端升级）。这将用于扁平化琼脂糖。 重要信息：确保垫片形式按用镊子与玻璃密封，否则媒体/琼脂糖干出来的。 </li></ol> P<html>花边营养磁盘重要事项：步骤5至10必须做一个幻灯片复杂一次;否则，媒体/琼脂糖开始凝固造成影片质量差。 <ol start="5"><li>删除营养磁盘复杂的形式4℃（第5步，从第3部分）和撬除了揭露现在凝固CTTYE /琼脂糖幻灯片。 </li><li>删除CTTYE媒体/琼脂糖从1毫米直径的“营养磁盘”远高于使用100μL玻璃一次性尖端的微型采样吸管放置在垫片上创建的盖玻片（上述第3步） 。 </li></ol>倒板 关键的一步 <ol start="7"><li>移液器〜300μL的55 °彗星TPM媒体/琼脂糖到盖玻片和包含的营养磁盘上的垫片创建。 TPM媒体/琼脂糖应土堆。 关键的一步 </li><li>将火焰消毒幻灯片没有TPM媒体/琼脂糖上的垫片（从第3步）。 重要说明：这张幻灯片必须设置的角度，以防止形成气泡。 </li><li>幻灯片（从第5步）一旦到位，钳复杂连同小长尾夹 - 每边一个。 </li><li>裁剪复杂放置在4 ° C和允许媒体/琼脂糖设置。这通常需要大约5分钟。 </li></ol>单独和干板重要信息：要防止干燥媒体/琼脂糖，11到20步，只应在一个幻灯片复杂执行一次。 重要提示：为了获得最佳结果，11到13步，应在4 ° C。 <ol start="11"><li>一旦媒体/琼脂糖设置，删除长尾夹，挤压复杂松开胶带包裹的幻灯片。 </li><li>取下胶带包裹的幻灯片，并进一步使用的长凳上。 关键的一步</li><li>使用镊子作为一个楔子，单独从支持幻灯片（无垫片）盖玻片/垫片/媒体/琼脂糖复杂和丢弃的支持幻灯片。 重要事项：不要使用撬议案，独立的盖玻片/垫片复杂。这可能导致在盖玻片打破和/或媒体/琼脂糖坚持支持幻灯片。 </li><li>放置盖玻片上的胶带包裹的幻灯片/垫片/媒体/琼脂糖复杂（垫圈朝上），删除4 ° C。将这个复杂的刻录机，让所有可见的新暴露的媒体/琼脂糖表面水分蒸发 - 不超过1分钟。 要点：不要让媒体/琼脂糖干太长，因为这可能会影响M。 xanthus群的行为。 </li></ol>板细胞关键的一步<ol><li>一旦多余的水分蒸发，吸管集中细胞上的媒体/琼脂糖约1毫米，从营养上（第1部分中的步骤8）0.5μL。 重要提示：这是极为重要，以确保细胞存入移动吸管，直降，然后是直线上升。这将确保群将是圆形的。 重要事项：不要触摸枪头向媒体/琼脂糖这是极为重要的。这将使得表面上的抑郁症和改变行为的 M. xanthus群。 提示：压低在接近媒体/琼脂糖的枪头。这将使细胞下降，出现在吸头的底部，并使其更易于存款细胞。 </li><li>一旦细胞的沉积，将复杂的燃烧器，让干细胞现场 - 不超过20秒。 </li></ol>组装检测<ol><li>一旦干细胞当场封面上的防滑垫片/垫圈/媒体/琼脂糖/细胞复合物（从第13步），配合幻灯片/垫片复杂（从第1步），并轻轻按压在一起，形成一个密封。 关键的一步</li><li>清洁表面的幻灯片和盖滑与Kimwipe删除左边的封口膜的残留。完成检测应该类似于图1。 </li><li> （滑下放在保持在32℃的加热阶段完成的幻灯片复杂，盖玻片）后立即擦拭（15步），以避免水汽凝结形成形成。如果形成结露，让几秒钟之前开始的图像采集软件幻灯片上加热阶段的复杂坐。 </li><li>选择适当的目标（2X，4X，或10X）。 </li></ol>第5部分：电影的制备T“的关键一步<ol><li>打开相机和显微镜，并检查灯光亮度（确保光线不是太激烈）。启动电脑，然后打开图像采集程序。 </li><li>点击实时图像窗口和聚焦显微镜。图像应该出现类似如图3所示的。请注意，琼脂表面均匀。 </li><li>开始获取图像。 关键的一步</li><li>定期检查的重点，在第一个小时，媒体/琼脂往往解决造成焦点漂移。 </li><li>干净的工作区域。 </li><li>一旦完成图像采集，传输收购存储图像，并打破90％的乙醇浸泡过夜幻灯片复杂。 </li><li>高压灭菌器垫片重用。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。TM板复杂的卡通插图。 （A）给出了在爆炸视图和断面的基本TM板复杂。 （b）显示了较大的垫圈使用。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。显微镜集群。每个显微镜节点（插图）由尼康E400显微镜，目标，激烈的阶段，透视相机，笔记本电脑。每个节点通过网络连接在一起，并链接到主控制器的计算机。两个节点的设立与EXFO光源和两个Uniblitz百叶窗组成的的荧光功能。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="图3" /> 图3。20X的跟踪检测仪器的图像在时间= 0 。比例尺，1毫米。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="图4" /> 图4。TM板复杂的适应性。 （一）M. 100X形象xanthus滑翔运动的CTTYE在1.0％的琼脂。 （二）P. 20X形象假单胞菌抽搐蠕动。 （三）20倍影像S.沙雷氏菌蜂拥蠕动。 （二）及（C）测定在1.0％琼脂的LB。 （四）M. 40X形象耻垢的LB滑动在0.5％的琼脂蠕动。使用替代实验配置图1B看到此图片被抓获。 视频1。一个时间推移视频跟踪检测群。 视频2。一个M.时间推移视频xanthus群，其中1％的细胞荧光标记。被抓获的交替阶段，对比和荧光图像和覆盖澄清荧光细胞群内的位置。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。 视频3。M 的时间推移视频xanthus滑翔运动的。 CTTYE在1.0％的琼脂，该视频被抓获。 一个P 的时间推移视频视频4。 假单胞菌抽搐蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。 S 的 ​​时间推移视频视频5。 沙雷氏菌蜂拥蠕动。该视频被抓获就在1.0％琼脂LB。 M 的时间推移视频录象6。 耻垢滑动蠕动。该视频被抓获使用替代实验配置图1B看到LB在0.5％的琼脂。

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	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

定时microcinematography（TM）已经成为一个标准的方法来研究原核蠕动2-7。传统上，商标是由基板8-11使用滤纸芯，薄琼脂垫，或琼脂砖。这些方法是适当和符合成本效益的，使用时为一般细菌运动插图产生的图像序列。但是，如果图像序列的结果必须产生重复性好，定量严谨的数据，这些方法都是费时又有点不可靠。例如，人为错误造成的这些技术的变化可能导致各种各样的不准确?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

δ- proteobacterium 黏细菌群包含数以百万计的细胞作为一个集体，协调运动通过一系列信号来创建复杂的，动态的模式，为应对环境线索。这些模式是自我组织和应急，他们无法通过观察单个细胞的行为的预测。使用时间推移microcinematography跟踪检测，我们确定了一个鲜明的新兴模式，在M. xanthus所谓的趋化作用，作为一个群的定向运动了对营养源 1梯度定义。 为了有效地表征microcinematography趋化通过时间推移，我们开发了一个高度修改板复杂（图1）和建造的8显微镜（图2），每一个能够捕捉时间推移视频集群。检测是严格的，足以让一致的，可量化的数据复制，产生的视频，让我们来观察和跟踪群行为的微妙变化。一旦捕捉到的视频转移到分析/存储计算机与足够的内存来处理和存储成千上万的视频。此设置的灵活性，已证明是有益的几个成员的M. xanthus社会。

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

研究<em&gt;黏细菌</em&gt;群的行为，我们设计了一个时间推移microcinematography协议，可用于不同的检测修改。它采用的是标准的显微镜适应增长的条件下，使用价格低廉，可重复使用的硅胶垫片，并产生可重复的结果。我们已经用这种方法来量化的多细胞的趋化。

在录制多细胞行为黏细菌生物膜，使用定时Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K 次观看.  University of South Carolina (USC). 研究黏细菌群的行为，我们设计了一个时间推移microcinematography协议，可用于不同的检测修改。它采用的是标准的显微镜适应增长的条件下，使用价格低廉，可重复使用的硅胶垫片，并产生可重复的结果。我们已经用这种方法来量化的多细胞的趋化。