这项工作是由赠款5号U54通过西方优秀的区域中心（WRCE）AI057156 - 07，R01从国家过敏和传染病研究所AI08764301 - A1，西利疫苗开发中心，在大学内部资金德克萨斯州医学科。

1。 2质粒DNA的重组的MP - 12编码NSS突变（S）的回收<ol><li>传播幼仓鼠肾（BHK）/ T7 - 15 9细胞，稳定表达T7 RNA聚合酶，到6厘米的菜最起码的基本介质中（MEM）-α（Invitrogen公司，CAT＃32561037），含10％胎牛血清（ FBS ），青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）（Invitrogen公司，CAT＃15140122），和600微克/ ml的潮霉素B（Cellgro，猫＃30 - 240 - CR）。 *病毒回收效率在6厘米的菜高出35 mm培养皿中。 BHK/T7-9细胞，通过水平低的支持率较高的恢复。另外，其他的BHK细胞株稳定表达T7 RNA聚合酶可以使用4,5,16,17。 </li><li>当细胞达到70％-80％汇合，更换培养上清用新鲜的含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B）的MEM -α。 *细胞应该是transfected内1小时后更换介质，以避免损失的T7 RNA聚合酶表达。 </li><li>对于RVFV，编码病毒基因组RNA的全长的病毒RNA表达质粒，恢复和病毒基因的开放阅读框，编码病毒蛋白表达（ 图1和2）第二组是必需的。准备在1.5毫升管以下plasmids2（ 图2）的混合物： <ol><li> pProT7 - S与NSS基因突变（2毫克）（S）（+）：这种质粒编码的抗病毒感（正面意义）全长RVFV MP - 12的S段两侧由T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）核酶序列。 </li><li> pProT7 - M（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极意义）全长RVFV MP - 12米段两侧由T7启动子和HDV核酶序列。 </li><li> pProT7 - L（+）（2毫克）：这种质粒编码的抗病毒感（积极的意义上）全长RVFV MP - 12 L型段FLAnked由T7启动子和HDV核酶序列。 </li><li> PT7 - IRES - VN（2毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12 N打开阅读框（ORF），T7启动子和脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游。 </li><li> PT7 - IRES - VL（1毫克）：这种质粒编码的RVFV MP - 12大号的ORF下游的T7启动子和EMCV IRES的。 </li><li> pCAGGS - VG（1毫克）：这种质粒编码RVFV MP - 12的M ORF的鸡β-肌动蛋白启动子的下游。 PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG此外没有恢复MP - 12所必需的，但它增强了救援效率2。作者通过PT7 - IRES质粒，可能是由于缺乏核糖体AUGs漏水扫描经历GN / GC不善表达。因此，我们构建了第依赖GN / GC表达pCAGGS - VG。 </li></ol></li><li>添加30毫升过境LT1（Mirus，CAT＃MIR2300）385毫升OPTI - MEM（InvitrogeN，CAT＃31985070）在1.5 ml管，涡简要。 </li><li>在室温下5分钟孵化后，慢慢加入OPTI - MEM包含从步骤1.3脂质体的质粒混合，混合轻轻吹打，并培育在室温为15分钟。 </li><li>步骤1.2一滴一滴地（ 图3）BHK/T7-9细胞的培养基中添加脂质体和质粒混合物。 </li><li>在孵化器孵育转染细胞在37 ° C，5％CO 2 24小时，并更换培养上清新鲜MEM -α含10％胎牛血清和青霉素，链霉素（不含有潮霉素B ）。 </li><li>细胞在37 °的孵化器中的C与5％CO 2为4天（共5天孵化），并收集到15毫升管培养上清液。 *这里观察细胞病变效应（CPE），并不一定反映病毒成功复苏的结果，因为转诱导细胞死亡，出现类似病毒RNA复制或病毒蛋白的合成引起的CPE。 </li><li>在4 ° C 5分钟，在2200 XG离心的上清液。 *这一步的目的是沉淀下来的细胞碎片病毒股票。气溶胶紧离心桶建议以提高安全性。 </li><li>转移到螺丝帽的5毫升cryotubes的上清液，存储通道0（P0），于-80 ° C为进一步利用病毒的股票。 </li></ol> 2。扩增病毒的P0 <ol><li>在P0样品往往含有病毒滴度不足2下游实验。在VeroE6细胞扩增步骤，这是一个克隆的非洲绿猴肾细胞（VERO）缺乏IFN-alpha/beta基因18,19，增加病毒滴度最高水平。另外，其他细胞缺乏IFNAR1敲除小鼠21 migh如20 Hec1B细胞或MEF细胞类型，我干扰素反应T是用于这一步。蔓延到贝科的修改最低必不可少的培养基（DMEM）（Invitrogen公司，CAT＃11965092）10厘米含10％胎牛血清菜VeroE6细胞，青霉素，链霉素（青霉素：100单位/毫升，链霉素：100毫克/毫升），和孵化在37 ° C孵化器与5％的CO 2，直到他们达到80％汇合。 *重组MP - 12菌株编码突变NSS往往不能有效的I型干扰素主管细胞复制。 </li><li> 2.7毫升10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM混合300毫升的P0样本。删除步骤2.1 VeroE6细胞培养基和稀释P0样品更换。在37 ° C的一个孵化1小时，5％CO2孵育。 </li><li>取出接种10毫升的DMEM添加10％胎牛血清和青霉素链霉素每道菜。 </li><li>在37 ° C孵育3〜4天，直到VeroE6细胞CPE明显。 *单层中断期间发生的MP - 12感染，whilË重组MP - 12缺乏NSS如rMP12 C13type（C13type）（ 图4），不破坏单 ​​层，但浮动细胞死亡人数出现在感染后2至3天。 </li><li>收获上清，在3至4 DPI节1.9）和1.10所述），并指定为E6P1样品。 </li></ol> 3。滴定斑块检测重组MP - 12 <ol><li> VeroE6细胞扩散到6孔板。 *每个样品的重复分析比单个分析更可靠。 </li><li>当VeroE6细胞生长至80％汇合，准备与10％FBS和10-6青霉素链霉素的DMEM 10倍系列稀释的病毒样本如下： <ul><li> 10μL的样品E6P1 + 990毫升，用10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM（10-2稀释） </li><li> 10 -2样品100μL+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 -3稀释） </li><li> 100μL的10 -3样品+ 900毫升的DMEM与10％胎牛血清和青霉素，链霉素（10 -4稀释） </li><li> 10-4样本100μL+ 900毫升与10％胎牛血清和青霉素链霉素的DMEM（10-5稀释） </li></ul></li><li>吸步骤3.1 6孔板中并添加每个稀释液（步骤3.2），400入井（ 图3） 。 </li><li>在37 ° C的一个孵化1小时，5％CO2孵育。 </li><li>在潜伏期，准备如下的琼脂覆盖两个15毫升管： 管（保持在42℃水浴）：7毫升1.2％的崇高琼脂水（VWR，猫＃101170-362） 管B（保持在37℃水浴）：7毫升改良Eagle培养基（MEM 2X）（Invitrogen公司，CAT＃11935046），含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升），和10％Tryptose磷酸盐肉汤（MP生物医学，CAT＃1682149）。 </li><li>孵育1 h后，删除病毒接种，并立即加入2毫升，每口井的管和管B（步骤3.5）1:1混合。 *小心添加覆盖，立即干燥井导致未受感染的细胞死亡。 </li><li>板块与5％的CO 2孵育3天的孵化器在37 ° C。 </li><li>准备管和管B再次在步骤3.5中所述。还准备500微升0.33％中性红的解决方案，每盘这也是保持在37℃水浴（西格玛Aldrich公司，CAT＃N2889 - 100ML）。 </li><li>混合管，管B和中性红溶液500毫升（终浓度为0.011％），加2毫升每口井的混合物。 *要添加的中性红溶液的量的变化很多中性红溶液，是必需的初步优化。 0.33％中性红溶液长期储存会导致沉淀。在这种情况下，可完全溶解沉淀，孵育在55 ° C为10分钟剧烈摇晃。使用沉淀中性ř弱阳性细胞ED解决方案的结果，而重新溶解中性红溶液污渍细胞以及。 </li><li>板孵育16小时（或过夜）37 ° C的一个孵化器5％的CO 2。 </li><li>统计斑块的数量，以及其中包含的10％到100％以及斑块。计算斑块的形成单位/ ml。例如，如果我们观察接种10-5稀释，28（＃斑块）×（1 ml/0.4毫升）× 10 5（稀释）= 7.0 × 10 6斑形成单位（PFU）的井28斑块/毫升（ 图5）。 </li></ol> 4。 NSS突变体的筛选缺乏I型干扰素抑制功能<ol><li>传播C57/WT MEF细胞（InvivoGen，CAT＃MEF - c57wt），编码一种分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因诱导的NF - kB和IRF - 3 / 7（ 图6），到12孔板。 DMEM培养细胞均保持在10％胎牛血清，青霉素，链霉素（Penicillin：100单位/毫升，链霉素100微克/毫升），稻瘟素S（3毫克/毫升），和Zeocin（100微克/毫升）。 </li><li>当细胞成为融合（80％），细胞模拟感染或感染与MP - 12或重组MP - 12编码的多重感染（MOI）3或0.1（见第2和第3，金额NSS突变每接种300μL）。在感染后1小时，取出接种，并添加1毫升含10％胎牛血清，青霉素，链霉素（青霉素100 U /毫升，链霉素100微克/毫升）每口井的DMEM（稻瘟素和Zeocin不添加在这个时间）。 </li><li>在感染后14小时，收集培养上清。添加200μL定量蓝（InvivoGen，猫＃REP - QB1），每个样品50μL（一式三份），一个96孔板井。密封板在37 ° C孵育1小时 * MP - 12和重组的MP - 12缺乏NSS清楚地诱导主机包括293细胞，MRC - 5细胞和鼠标embr IFN-alpha/beta胜任细胞的翻译抑制yonic成纤维细胞（MEF）的14个小时后，在高MOI感染后的细胞。另一方面，IFN -βmRNA或ISG56 mRNA的大量积累在7至8小时后感染的类型，我干扰素胜任细胞。因此，我们选择了感染14小时后收集上清，看到的先天免疫反应诱导SEAP的积累。 </li><li>阅读使用酶标仪（ 图7）在650 nm处的OD值。 *北使用特定的鼠标ISG56基因ISG56 NSS表达的情况下（ 图 8）的mRNA的上调，这表明RNA探针的杂交获得的数据相一致的结果。 应该指出，SEAP的活动是由丰富的蛋白质可以通过主机翻译活动的影响。的mRNA水平的提高相比，一个SEAP的相对水平可能不高，因为SEAP不能SEAP基因的存在，即使在合成细胞翻译suppressed。 Northern杂交是一种更直接的检测和更准确地评估在感染的细胞比SEAP报告基因检测NSS功能的缺乏引起的mRNA量。然而，SEAP报告系统比Northern杂交更迅速，因此NSS可能缺乏主机转录抑制功能的突变体的快速筛选有用。 </li></ol> 5。代表性的成果： 反向遗传学系统不断生成可行的重组MP - 12病毒滴度大于1 × 10 6 PFU / ml的高。 C13type病毒缺乏NSS的功能形成了大量的混浊斑，而MP - 12明确斑块形成各种大小的2（图5）。模拟感染C57/WT MEF细胞或MP - 12的感染者并没有增加SEAP的水平相比，模拟病毒感染的细胞培养上清，而与C13type C57/WT MEF的感染细胞的培养上清中增加SEAP的水平，14小时后感染（HPI）（图7）。这些结果与北使用特定的鼠标ISG56 mRNA表达（图8）RNA探针的杂交获得的一致。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig1.jpg" alt="图1"/> 图1。RVFV的基因组结构 RVFV有三方负感或ambisense RNA基因组命名为S，M -和L -段。分部的S - N和NSS基因编码ambisense方式。从病毒感（负义）段的S - ñ mRNA的合成，而mRNA是合成抗病毒感（积极意义）分部的S - NSS。分部的M -编码一个M mRNA和合成5&#39;region他们合作翻译裂解22,23 M的mRNA的几个AUGs漏水扫描the78kD，NSM，GN或GC蛋白。分部L - L蛋白编码。 N和L蛋白是病毒的转录和复制所必需的，而Gn和GC病毒包膜蛋白。 NSS和NSM蛋白非结构蛋白，这是不纳入到病毒颗粒。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig2.jpg" alt="图2"/> 图2。质粒DNA重组RVFV MP - 12菌株的恢复设计 全长cDNA的反病毒检测的S，M或L段cloneddownstream T7启动子和丁型肝炎病毒（HDV）上游核酶序列，指定为pProT7 - S（+），pProT7 - M （+）或pProT7 - L（+）分别为2。 BHK/T7-9细胞中表达T7 RNA聚合酶转录的RNA编码全长S，M，或精确的基因组3&#39;末端L型部分。 N或L蛋白的开放阅读框（ORF）克隆脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES），这是PT7 - IRES - VN或PT7 - IRES - VL，分别指定，允许不封顶T7 RNA转录在限额，独立的核糖体被认可凹痕的方式。的M的ORF克隆下鸡β-肌动蛋白pCAGGS质粒24，这是pCAGGS - VG指定的推动者，让78kD的合成，NSM，Gn和GC蛋白，这是从不同AUGs产生漏水扫描23。 N和L蛋白启动转录或RNA的复制，而PT7 - IRES - VN和PT7 - IRES - VL没有必要重组的MP - 12 2的恢复，可能是由于presumable的渗漏表达POL二，驱动皑皑的RNA转录编码的N - ORF和L - ORF的pProT7 - S（+）和pProT7 - L（+），分别。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig3.jpg" alt="图3"/> 图3 RVFV MP - 12质粒DNA的回收 。 pProT7 - S（+），pProT7 - M（+）pProT7 - L（+），PT7 - IRES - VN，PT7 - IRES - VL和pCAGGS - VG质粒（图BHK/T7-9细胞转染）生成传染性重组RVFV MP - 12培养上清中的应变第在5天的后转上清收集，到新鲜VERO E6细胞病毒扩增传代。通常情况下，超过1 × 10 6 PFU / ml的病毒在感染后3〜4天可以恢复。扩增的病毒（E6P1病毒）滴定使用Vero E6细胞斑块检测和表型分析和免疫原性研究。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig4.jpg" alt="图4"/> 图4段的S - MP - 12和rMP12 - C13type MP - 12的比较和rMP12 C13type（C13type）的S -段。 C13type NSS的ORF与MP - 12菌株NSS相比，被截断了69％，是相同的自然隔离克隆13 株 2,25 。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig5.jpg" alt="图5"/> 图5牌匾MP - 12（功能NSS）和C13type（非功能NSS）检测。 单层的Vero Ë6细胞在6孔板是用于检测斑块。经过3天用0.6％的琼脂覆盖，第二琼脂覆盖含有中性红溶液孵化的是。然后，感染后第4天计算斑块。 MP - 12的形式明确不同大小的斑块，而C13type形式大混浊斑块（或灶）。以及10至100斑块应用于计数。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig6.jpg" alt="图6"/> 图6的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）记者在C57/WT MEF细胞的基因激活途径 干扰素-β启动子包括AP - 1，NF - kB和IRF - 3的结合序列。 RVFV复制激活AP - 1，NF - kB和IRF - 3 7,11。然而，抑制IFN -β启动NSS释放阻遏复杂，即使在这些转录因子的结合，从而抑制IFN -βmRNA的26的合成。此外，NSS隔绝TFIIH P44 subunits8和LSO促进TFIIH P62亚基27的降解，从而诱导普通主机的转录抑制，包括IFN -α基因和基因ISRE子下。 IFN -β的抑制功能的C13type或其他缺乏NSS突变体诱导IFN -β的合成，这反过来又激活IFN -α启动子和干扰素敏感反应元件（ISRE）发起人。 IRF - 7，然后IFN-alpha/beta刺激和支持IRF - 3 28,29的进一步上调IFN -α转录上调。在这个实验中，C57/WT MEF细胞分泌碱性磷酸酶（SEAP）编码在一个人工NF - kB的，IRF - 3和IRF - 7的结合序列下游。因此，NSS突变体，缺乏IFN -β的抑制功能上调SEAP的分泌，然后测量。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig7.jpg" alt="图7"/> 图7由C13type SEAP的感应。 C57/WT MEF细胞（InvivoGen）分别模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）3（左侧面板）或0.01（右图）MOI。培养上清14 HPI（50μL）与200μL定量蓝（InvivoGen）在96孔板和650 nm处的OD值基板混合后测定1 h后在37 °彗星由酶标仪。 SEAP的模拟病毒感染的细胞相对增加。这些数据代表的平均+ / - 3次独立实验的标准偏差。从C13type感染的细胞培养上清显示SEAP的增加，表明主机转录抑制NSS缺乏。 <img src="/files/ftp_upload/3400/3400fig8.jpg" alt="图8"/> 与高辛标记的RNA探针Northern杂交图8。 野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的模拟感染或感染与MP - 12或rMP12 C13type（C13type）MOI 3。总RNA用Trizol（Invitrogen公司），和北b 7 HPI大量使用地高辛标记的RNA探针的具体小鼠内源性ISG56 mRNA或MP - 12 N基因/抗病毒检测的S 段 2,30 。为了使小鼠内源性ISG56 mRNA或RVFV ñ基因/抗病毒检测的S段的探针，引物的PCR扩增片段KpnmISG56F（GGG TGG TAC总部大楼台泥法案TTC AGA海合会TTC GCA AAG CAG）和HindmISG56 （TAC AAA级GCT达GGG AGA GAA TGC TGA TGG TGA文建会GG）为ISG56 mRNA或KpnNF（AGT TGG TAC猫GGA民航局注册税务师TCA AGA GCT TGC摹）和HindNR RVFV（GGG民航局GCT TTT AGG CTG C​​TG的大老山隧道的TGT AAG） ñ基因/抗病毒检测的S段消化用 KpnⅠ 和 HindⅢ，结扎成pSPT18质粒（Roche.然后RNA与地高辛标记的探针合成，使用辛RNA标记试剂盒（SP6/T7）（罗氏猫＃1 175 025），每个样品的28S rRNA的水平也显示装载控制。野生型MEF的C13type诱导ISG56 mRNA合成受感染的细胞，而那些与MP感染-12没有诱导，暗示缺乏主机在C13type感染细胞的转录抑制。图6 SEAP检测所获得的数据是一致。

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li><li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines.">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF(HOS)+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor.">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li><li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+M+segment:+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology.">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li><li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+M+segment:+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression.">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clone+13,+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus,+which+is+altered+in+the+small+segment.">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li><li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells.">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li><li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62.">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li><li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense.">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li><li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7.">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li><li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment.">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li><li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection.">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li><li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs.">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li><li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease.">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li></ol>

我们什么都没有透露。

为RVFV反向遗传学系统已经开发了几个小组利用T7启动子2,4,5或鼠标3人4 POL -我子。在这个手稿中，我们描述了一个协议， 使用15个稳定表达T7 RNA聚合酶BHK/T7-9细胞产生重组RVFV MP - 12菌株。不同的病毒回收效率取决于BHK/T7-9细胞的条件，质粒量，转染细胞和数量等。我们总是放大的P0病毒在Vero E6细胞，获得高滴度实验的病毒储存。 I型干扰素主管的细胞，如人肺二倍体?...

<table border="1"><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论（可选） </td></tr><tr><td>最低限度的基本培养基（MEM -α） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td>贝科的修改最低限度的基本培养基</td><td> Invitrogen公司</td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td>改良Eagle培养基（MEM 2X） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td>青霉素链霉素</td><td> Invitrogen公司</td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B </td><td> Cellgro </td><td> 30 - 240 - CR </td><td></td></tr><tr><td> Tryptose磷酸盐肉汤</td><td> MP生物医学</td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td>高贵的琼脂</td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td>中转- LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> OPTI - MEM </td><td> Invitrogen公司</td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td>气溶胶紧盖子</td><td> Eppendorf公司</td><td> C - 2223 - 25 </td><td></td></tr><tr><td> 0.33％的中性红溶液</td><td>西格玛爱秩序</td><td> N2889 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF细胞</td><td> InvivoGen </td><td> MEF - c57wt </td><td></td></tr><tr><td>稻瘟素小号</td><td> InvivoGen </td><td> ANT - BL - 1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> ANT - ZN - 1 </td><td></td></tr><tr><td>定量蓝</td><td> InvivoGen </td><td> REP - QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9细胞15 </td><td>日本岐阜大学， </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero E6细胞</td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td><td></td></tr></table>

using reverse genetics to manipulate the nss gene of the rift valley fever virus mp-12 strain to improve vaccine safety and efficacy

裂谷热病毒（RVFV），从而导致出血热，神经系统疾病，或在人类中的盲目性，以及高利率流产和反刍动物的胎儿畸形1，已被列为作为HHS /美国农业部重叠选择代理和风险组3病原体。它属于在家庭Bunyaviridae属Phlebovirus，是这个家庭的最致命的成员之一。自2006年以来已开发的RVFV MP - 12疫苗株2,3以及野生型RVFV 4-6株，包括ZH548和ZH501，几个反向遗传学系统。 MP - 12株（这是一个危险群2病原体和非选择代理）是由几个突变，其M -和L段高度减毒，但仍带有剧毒分部的S - 3，其编码的RNA功能的毒力因素，NSS。 rMP12 C13type（C13type）进行帧删除NSS的ORF 69％缺乏所有已知的NSS功能，而它复制为efficient作为MP - 12在VeroE6细胞缺乏I型干扰素。 NSS包括干扰素（IFN）-βmRNA的7,8诱导的转录主机关闭，并促进在翻译后水平降解双链RNA依赖的蛋白激酶（PKR）9,10 IFN -β转录干扰素调节因子3（IRF - 3），NF - kB和激活蛋白-1（AP - 1），IFN -β结合IFN-alpha/beta受体（IFNAR）上调刺激IFN -α的转录虽然IRF - 3，NF - kB和激活的基因或其他干扰素刺激基因（ISGs）11，诱导宿主的抗病毒活性，而主机包括NSS IFN -β基因的转录抑制阻止病毒复制的基因upregulations这些ISGs蛋白1（AP - 1），可以通过RVFV7激活。 。因此，NSS是一个很好的的目标，以进一步削弱MP - 12，并取消IFN -β的抑制功能，以提高主机的先天免疫反应。这里，我们描述了产生重组MP - 12的编码突变NSS的协议，并提供一种检查方法，找出缺乏的功能，抑制IFN -βmRNA的合成NSS突变体的一个例子。除了 ​​其在先天免疫系统的重要作用，I型干扰素是重要的树突状细胞诱导适应性免疫反应 12-14的成熟。因此，NSS突变体诱导I型干扰素的进一步减弱，但在同一时间在刺激宿主的免疫反应更有效率比野生型MP - 12，这使得它们接种疫苗的方法理想人选。

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Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

裂谷热病毒的MP - 12疫苗株反向遗传学系统是一个有用的工具，用于创建附加的MP - 12突变体具有更高的衰减性和免疫原性。我们描述了协议的产生和表征NSS突变株。

利用反向遗传学操作的裂谷热病毒MP - 12菌株，以提高疫苗的安全性和有效性的NSS基因

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

17.2K 次观看.  University of Texas Medical Branch. 裂谷热病毒的MP - 12疫苗株反向遗传学系统是一个有用的工具，用于创建附加的MP - 12突变体具有更高的衰减性和免疫原性。我们描述了协议的产生和表征NSS突变株。