愿我们，感谢肯Nealson的整个手稿的准备过程中他的见解和建议。

1。病毒悬浮液的制备通过流式细胞仪分离出单个病毒颗粒之前，准备不固定的病毒悬液。 <ol><li>使用先前建立的协议，确保最终的病毒悬浮液中分离病毒颗粒被包含在0.1微米过滤TE液（Tris-EDTA，pH8）中。我们建议您使用其他方法虽然已开发出采用化学絮凝7切向流过滤（TFF）接近6。 </li><li>枚举使用既定的协议， 例如 ，使用萤光8-10或流式细胞仪11,12的病毒颗粒。 </li><li>病毒悬浮液的等分试样分成两个Eppendorf管中（最终体积是1,000微升）。 </li></ol> 2。流式细胞仪<ol><li>病毒使用BD FACSAria II流式细胞仪配备一个自定义的前向散射的PMT（FSC PMT）排序，稀释病毒颗粒在0.1微米过滤TE，pH值8。0到适当的事件发生率为200赛事秒-1滴度。 </li><li>设置阈值，以最大限度地提高信号与噪声的口粮， 例如 。含有T4和λ噬菌体颗粒的混合组合建议：在1000和SSC FSC PMT 200。 </li><li>运行100微升的“空白”样品只含有1）0.1微米过滤TE和2）0.1微米的过滤TE和SybrGreen1的1E-4的股票稀释（10,000倍）。 </li><li>运行一个小等分不染病毒悬浮液（100微升），以评估背景，其次是染病毒悬液（SybrGreen1 1E-4的股票稀释），病毒颗粒共5000事件。这是检查浓度和调整分配门，如有必要，在排序前。我们建议紧栅的中心的病毒颗粒。另外，门，我们使用的SYBR Green和FSC PMT情节。 </li><li>加入5μl的1％低熔点（LMP）琼脂糖（在TBE缓冲液）冷却至37℃到每个以及在一个聚四氟乙烯（PTFE）的显微镜载片上（电子显微学）。 </li><li>装入PTF​​E显微镜的幻灯片到流式细胞仪捕捉到排序的病毒颗粒。 </li><li> SYBR绿色染病毒颗粒直接到四氟滑板与LMP琼脂糖开始排序。我们建议使用10个或更多的事件（病毒颗粒）在某些井进行排序，以帮助在共聚焦激光扫描显微镜（CSLM）的深度的病毒的检测。 </li><li>当排序完成流式细胞仪，删除幻灯片，加入5微升LMP琼脂糖冷却到37°C，每孔，从而嵌入病毒颗粒（次）。 </li></ol> 3。可视化单的病毒粒子，利用共聚焦显微镜如果需要一个单一的病毒粒子，然后确定每个包含一个单独的病毒是势在必行，激光共聚焦显微镜是必要的，以可视化的嵌入式病毒颗粒（S）在3D验证，只有一个单一的粒子存在，而且多种病毒不堆叠在彼此的顶部。 <ol><li>置显微镜激光的波长488 nm激发。 </li><li>图片嵌入式病毒颗粒使用63X长工作距离的目标。 </li></ol> 4。全基因组扩增<ol><li>井与单一病毒一旦确定与激光共聚焦显微镜，琼脂糖（ 原位 ）内使用多重置换扩增（MDA）进行全基因组扩增。 </li><li>为了减少引入DNA污染的可能性，取出所需的琼脂糖珠从滑动，并放置在无菌的PCR管中。使用无菌镊子和/或刀片用于此步骤中的一对。 </li><li>裂解病毒粒子中就地采用热（94℃）的热循环仪的加热块中的3分。 </li><li>执行以下修改MDA反应下列制造商的建议（GenomiPhi HY试剂盒，GE医疗） <ol><li>减少体积的样品和反应BUF指11.25微升和孵化，在30°C，最多2小时，以减少非特异性扩增。 </li></ol></li><li>纯化扩增的基因组物质的基因组DNA（基因组DNA）转移到1.7毫升的Eppendorf管中，加1/10体积的3M醋酸钠（醋酸钠）在TBE缓冲液（LMP琼脂糖凝胶制剂中使用的相同的缓冲液）。 </li><li>将样品（次），在55℃10分钟以溶解琼脂糖。 </li><li>移动管（S）到42℃，以减少温度之前加入酶。 </li><li>新增2个β-琼胶每个管和孵化2小时。 </li><li>加入1倍体积的缓冲液饱和的苯酚溶液的试管中，剧烈混合，在3500×g离心15分钟，离心。将上清转移到新的1.7毫升的Eppendorf管中含有DNA。 </li><li>添加一个体积100％异丙醇和加入1μlGlycoblue。拌匀倒相管。 </li><li>在4℃以28,000 xg离心60分钟。倒出异丙醇，确保不打扰颗粒。加入150μl70％ETHA酚每个试管中。旋转28,000的XG及RT 10分钟。倒出乙醇，空气干燥DNA沉淀，并在适当体积的TE缓冲液中重悬DNA。 </li><li>我们建议以下修改重复步骤4.4-4.9。设置3-5复制MDA反应和减少孵化，在30℃至1小时。池样品后，纯化和沉淀物，用95％-100％的乙醇，以取得所需的浓度。 </li></ol> 5。代表结果 图1总结了SVG过程。这些方法使用流式细胞仪检测到病毒颗粒PTFE显微镜载玻片含琼脂糖分离单个的病毒颗粒从混合组合，然后由MDA获得数量足够进行测序的基因组DNA进行排序。 作为一个证明的概念，λ噬菌体T4混合SVG过程11。病毒颗粒一旦被抓获，并嵌入琼脂糖，激光共聚焦显微镜WA用来在不同可视化和确认一个单一的病毒粒子，得到的结果示于图2中，一旦与单个病毒粒子的孔中被确定，他们被选择为丙二醛（MDA）的基因组DNA。然后，我们使用的多重PCR具体T4和lambda来识别这种病毒的分离， 如图3所示。一个孤立的噬菌体基因组测序选择。 进行基因组测序，使用454-乙酸进行引用映射到识别的覆盖水平得到使用SVG的技术和测序读取。 如图4所示，几乎整个的λ基因组回收（与异常的第5个碱基）。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig1.jpg" /> 图1。 SVG方法。含有病毒悬液混合组合减少到单个病毒颗粒通过流式细胞仪则sorted到个人琼脂糖“珠”。该病毒嵌入在琼脂糖珠叠加一层额外的琼脂糖后流式细胞仪分选。最后， 在原位进行全基因组扩增。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig2.jpg" /> 图2。激光扫描共聚焦显微镜的排序病毒粒子嵌入在琼脂糖珠A）三维重建的SYBR Green I的的染病毒颗粒内的琼脂糖珠。插图：更高的放大倍率孤立的病毒粒子B）剖面图相对荧光染色的单个病毒颗粒内的琼脂糖珠。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig3.jpg" /> 图3。噬菌体鉴定采用PCR A）&lt;/ STRONG&gt;多重PCR使用T4和lambda特异性引物的基因型，车道：1。则TrackIT 1 kb的加入水口（Invitrogen公司），2。拉姆达整合（750 bp）的，3。 T4的主要衣壳蛋白（1050碱基对），4。混合的lambda整合和T4的主要衣壳蛋白B）后续的lambda与其他位点特异性PCR进一步证实噬菌体基因组隔离，车道：1。拉姆达整合（750 bp）的，2。拉姆达阻遏（356个基点）3。拉姆达SIE（二重感染排除）（456个基点）4。则TrackIT 1 KB加梯（Invitrogen公司）。 <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/3899/3899fig4.jpg" /> 图4。拉姆达基因组属性和覆盖范围。）GC情节，B）的基因组图谱的lambda（改编自<a href="http://img.jgi.doe.gov" target="_blank">http://img.jgi.doe.gov</a> ），和C）的SVG读取映射参考λ噬菌体，x轴基因组的位置，雅红双喜％的覆盖率。

<ol>
	<li>Raghunathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+DNA+amplification+from+a+single+bacterium.">Genomic DNA amplification from a single bacterium.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).</li><li>Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomic+sequencing+using+Multiple+Displacement+Amplification.">Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).</li><li>Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+single+microbial+cells+from+environmental+samples.">Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).</li><li>Edwards, R. A., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+metagenomics.">Viral metagenomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).</li><li>Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+viruses+in+the+environment.">Roles of viruses in the environment.</a> Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).</li><li>Williamson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+metagenomic+characterization+of+viruses+within+aquatic+microbial+samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456 (2008).</li><li>John, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+concentration+of+ocean+viruses+by+chemical+flocculation.">A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).</li><li>Noble, R., Fuhrman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+viruses+in+marine+waters:+assessment+by+epifluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).</li><li>Hennes, K. P., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+counts+of+viruses+in+natural+waters+and+laboratory+cultures+by+epifluorescence+microscopy.">Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy.</a> Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).</li><li>Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+marine+viruses+in+culture+and+natural+samples+by+flow+cytometry.">Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).</li><li>Brussaard, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophages+using+flow+cytometry.">Enumeration of bacteriophages using flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).</li><li>Allen, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Virus+Genomics:+A+New+Tool+for+Virus+Discovery.">Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+cloning+using+phi+29+DNA+polymerase.">Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

应用SVG方法时，必须考虑一些重要因素。基因分型，在概念证明型实验13，是不是保守引物的环境或未知的菌株可在所有病毒组的有效选项。此外，背景DNA合成或非特异性扩增常见的扩增过程中使用MDA反应14。非特异性扩增已被归因于新兴的反应试剂和/或通过一种机制，允许从随机六聚体在反应混合物中的扩增的DNA污染。当使用病毒的组合，有可能是一个更高的可能性由于作为粒?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer-saturated Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomiPhi HY kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-6600-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycoblue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td>15 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMP agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE microscope slide</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63430-04</td>
			<td>24 well, 4 mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SybrGreen</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7585</td>
			<td>10,000X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-agarase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0392S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and genome analysis of single virions using 'single virus genomics'

全基因组扩增和测序的单一微生物细胞使基因组特性，而不需要栽培1-3。病毒，是无处不在的，我们星球上的4最众多的实体和重要的在各种环境中5，通过类似的方法尚未透露。在这里，我们描述了一种方法，用于分离和表征单个病毒颗粒的基因组被称为“单个病毒的基因组学”（SVG）。 SVG利用流式细胞仪分离单个病毒和全基因组扩增，得到高分子量的基因组DNA（基因组DNA），可以用于在随后的测序反应。

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Isolation and Genome Analysis of Single Virions using &#039;Single Virus Genomics&#039;

单一的病毒基因组（SVG）是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合，用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖，从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增（MDA）的产生，是适合用于测序的基因组物质中。

使用“单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

isolation-genome-analysis-single-virions-using-single-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

10.8K 次观看.  The J. Craig Venter Institute. 单一的病毒基因组（SVG）是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合，用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖，从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增（MDA）的产生，是适合用于测序的基因组物质中。