这项研究的资金来源：特拉维夫大学的技术转移公司，拉莫特和示巴医学中心（M. CA和SI），ICRF - 以色列癌症研究基金会（M. CA）和以色列科学基金会的联合基金（ SI）。

1。细胞培养制备 MDA-MB-231细胞购自美国典型培养物保藏中心 （ATCC），并保存于液氮中。 <ol><li>种子10 6个MDA-MB-231细胞在92毫米直径的陪替氏培养皿在10毫升完全培养基中Dulbeco改进的Eagle培养基（DMEM），10％马血清，1％L-谷氨酰胺和1％两性霉素B。Penstrep允许细胞的激增至约80-100％汇合。 </li><li>从盘取出培养基并丢弃。 </li><li>简单细胞层洗净，用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液（W / V）的血清清除所有痕迹。 </li><li>添加2.0毫升胰蛋白酶-EDTA溶液菜倒置显微镜观察细胞，直到细胞层分散（通常在5至15分钟内）。 </li><li>加入18毫升完全培养基，用吸管轻轻吸出细胞。转移到管。 </li><li>在1,200 rpm离心细胞悬浮液。 </li><li>重悬细胞沉淀在24毫升的铜介质lture。 </li><li>加入2 ml的细胞悬液，以35毫米的玻璃底菜（约25％汇合），在培养箱（5％CO 2，37℃）。 </li><li> 解决方案： <ol><li>的完整的细胞的增殖培养基：DMEM培养基含10％FBS，1％抗生素（100单位/毫升青霉素G，100微克/毫升链霉素，笔链球菌AMPHO的溶液）和2mM L-谷氨酰胺。 </li><li>胰蛋白酶-EDTA溶液中，含有0.25％的胰蛋白酶-EDTA。 </li></ol></li><li> 菜： 92毫米直径的培养皿。 直径35毫米，聚-D-赖氨酸镀膜玻璃底培养皿。 </li></ol> 2。现场共聚焦成像单元的制备<ol><li>种子2×10 5 MDA-MB-231细胞的玻璃底培养皿中第1节中提到的2毫升完全培养基。当细胞培养达到60-70％汇合（约3-4×10 5细胞每盘），继续转。 </li><li>与ENCOD两个质粒转染的细胞ing的融合蛋白，γ-微管蛋白（GFP荧光检测中心体）和组蛋白红色（H2B红色，荧光检测染色体）采用脂质体转染试剂喷射PI，制造协议。简言之，混合2微克从每个质粒在管用100微升氯化钠（150毫米）。用100μl150mM的氯化钠（）的第二管中的转染试剂（100微升）混合，并在室温（RT）下孵育5分钟。然后将二者结合起来的解决方案，混合（使用温和涡）和自旋向下。在RT下孵育30分钟。 </li><li>在温育的转染混合物，洗涤细胞一次，用PBS和替换的细胞培养基中，用2毫升温暖的DMEM培养液（37℃）没有补充。 </li><li>轻轻加在DMEM培养液中的细胞的转染混合物，然后返回的细胞培养箱中（37℃，5％CO 2）8小时。 </li><li> 8小时的潜伏期后，更换2毫升完全培养基DMEM细胞在孵化器和孵化24小时。 </li><li>转染后24小时，更换的培养基中的细胞，用2毫升完全培养基中含有20μMPJ-34。 </li><li>孵育细胞18小时（37°C，5％CO 2）。 </li><li>主题的细胞生活共焦成像的细胞在5％CO 2和37℃下保持至少16小时，在成像室</li><li>同时，检查转染效率36小时转染后用荧光显微镜如下： <ol><li>种子2×10 5的MDA-MB-231细胞在6孔板含有1盖玻片，在2毫升完全培养基中每孔的。 </li><li>转染的细胞中提到的第2.2-2.5。 </li><li>转染后36小时固定安装在盖玻片上培养转染的细胞在冷甲醇：丙酮（1:1）溶液，7分钟，-20℃下</li><li>吸出固定的解决方案，让安装的细胞，干化学罩盖玻片。 </li><li>申请延长Gold抗淬灭试剂用DAPI，让日É盖玻片干燥6小时在黑暗中。 </li><li>在荧光显微镜下检查的幻灯片，并计算转染的细胞（红色和绿色信号）从总人口的细胞（DNA用DAPI染色）的百分比。 100-200细胞计数时所需的转染百分率大约是20％至40％。 </li></ol></li></ol> 3。现场共聚焦成像扫描仪设置的技术参数<ol><li> ScanMode XYZT;针孔通风] 1.00;变焦3.5;分辨率8位，561纳米激光DPSS氩气，可见激光488纳米激光他/ NE可见的633纳米目的HCX PL APO CS 63X 1.40油抗紫外线;数值孔径1.4;扫描速度700赫兹;折射率1.52。 </li><li> 3-D图像演示制备Imaris里成像软件7.0。 </li></ol> 4。固定细胞有丝分裂的共聚焦成像<ol><li>种子为2×10 5 MDA-MB-231乳腺癌细胞（ATCC），正常小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），或PARP1缺陷MEF（PARP - / - ，制备议员弗朗索瓦丝Dantzer）上在2毫升完全培养基的6孔板中的盖玻片。盖玻片，用96％乙醇洗涤后，用无菌DD水洗涤，干燥2小时，并放置在6孔盘的每个孔中。 </li><li> PJ-34（10-30微米）添加到培养基中，室温孵育规定时期内（通常可达96小时）。 </li><li>一旦清洗盖玻片，用PBS（磷酸盐缓冲液），并固定细胞，用孵化，在冰冷的甲醇：丙酮（1:1）溶液，-20℃下，7分钟</li><li>吸固定溶液，并让盖玻片化学罩中干燥（在此阶段，盖玻片可在-20℃保存数周）。 </li><li>用PBST（PBS含0.1％Tween-20的补充），一次清洗盖玻片通透细胞膜，并阻止细胞在RT下的1小时，用10％在PBST NDS（正常驴血清）（封闭溶液）。 </li><li>孵育通透固定细胞原发性antibodiES的RT 2小时（主轴和中心体染色）。如下：抗α微管蛋白（1:250稀释）和抗γ-微管蛋白（1:200稀释）在封闭液稀释抗体。一抗的应用方式如下：适用于将100μl（在下拉式菜单中）为每个盖玻片的6孔​​板盖（盖是上下颠倒）的封闭溶液中的抗体的混合物。轻轻把盖玻片上的抗体下降，面临着下降的种子细胞。孵育面临的抗体在室温下搅拌2小时的盖玻片。 </li><li>将盖玻片孔中，并用PBST洗涤细胞3次。然后用4.6所述的相同步骤，用荧光二级抗体标记细胞在盖玻片上。二次抗体1小时，RT孵育的细胞在盖玻片上，在黑暗中。该抗体稀释如下：封闭液的Alexa Fluor 488（1:1,000稀释，绿色）的Alexa Fluor 568（1:1,000稀释;红色）。 </li><li>安装盖玻片使用延长黄金的抗淬灭试剂用DAPI（染色体染色），在室温孵育过夜，在黑暗干燥。 </li><li>通过共聚焦显微镜检查盖玻片。 </li></ol> 5。 ATP的测量细胞活力 ATP产量测定发光ATP检测试剂盒。 <ol><li>种子细胞的96孔培养板中，在各孔中的800微升培养基中大约20,000细胞。应该用于测定介质的背景发光的三个空白孔。 </li><li>准备约10〜100μm的ATP标准品稀释系列，并保持在冰上。 </li><li>向每孔中加入50μl的洗涤剂和为5分钟，每分钟700转的轨道摇床中摇板。 </li><li>复溶试剂盒中的底物缓冲液，用5ml的的冻干基板的每个管形瓶中。 </li><li>加入50微升底物溶液的重组到各孔中，并摇动板轨道摇床，700转5分钟。 </li><li>保持板在黑暗的10分钟。 </li><li>测量每孔luminiscence用ELISA酶标仪。 </li></ol>

<ol>
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作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

实时共焦成像提供了一种实时PJ-34的细胞毒作用在活的多中心体的细胞在有丝分裂过程中（ 图3和补充信息）的文档。这是第一次现场文档PJ-34在人类癌细胞中的细胞毒性归因额外中心体聚类和细胞死亡，表明诱导细胞死亡的有丝分裂灾难PJ-34 5-9。与此相反，双焦聚类数目的超中心体中观察到活的未处理的MDA-MB-231细胞进行正常的有丝分裂与双向focali的群集的多余的中心体（ <str...

菲衍生PARP1抑制剂，包括PJ-34，旨在保护耗能PARP1介导的DNA修复应力条件下（中风或心肌梗死）1静止期细胞诱导细胞凋亡。然而，最近我们发现，PJ-34，比诱导PARP1抑制浓度高出一倍，完全可以导致细胞死亡在人类癌细胞中2,3。更快速的细胞增殖，细胞更有效地消灭了。 PJ-34的细胞毒活性归因于额外中心体聚集在有丝分裂2。许多人类癌细胞海港multicentrosomes 4,5。孵化人类乳腺癌细胞MDA-MB-231，怀有编外中心体，为20μmPJ-34有效地根除这些细胞在72-96小时内不损害静止细胞或一些良性增生的细胞，窝藏两个中心在有丝分裂<suP&gt; 2,3。良性的细胞包括人类乳腺上皮细胞MCF-10，人类内皮细胞（HUVEC），从人胸腺制备的原代骨髓间充质细胞。这些细胞耐PJ-34的细胞毒活性。 PJ-34没有干扰他们的细胞周期过程中培养96小时，或影响其中心体和双焦主轴形成2,3。 双极双极4,5在有丝分裂纺锤体的形成是至关重要的中心体组装。因此，有两个以上的中心体的细胞已经开发了一种几乎不理解的分子机制，多余的中心体，在两极4-9聚类。双极其中心体组装的失败可能会导致多极化扭曲纱锭和异常染色体分离逮捕细胞周期G2 / M期阻滞，并导致细胞死亡归因于有丝分裂失败4,5。额外中心体聚类的分子机制的深入研究&lt;SUP&gt; 10。了解这个死亡机制将启用独占消灭癌细胞的同时保留健康组织5,10。 因此，激活有丝分裂灾难细胞死亡的化合物有选择性的癌症治疗提供了一种新的模式，这可能是有效率的在广泛的人类固体cancers.Our结果的建议聚焦成像，可用于识别分子影响额外中心体聚类2,3有丝分裂，使这些化合物癌症靶向药物候选人。 我们已经证明通过扫描固定的和活的人体癌症细胞（额外中心体在有丝分裂的发生率较高），相对于正常细胞的细胞毒活性对菲啶PJ 34。一步一步描述用于识别PJ-34在人类癌症细胞的细胞毒活性的成像程序包括下面。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

菲衍生物作为有力PARP1抑制剂阻止编外中心体多中心体的人类癌症细胞有丝分裂的双焦聚类。菲啶PJ-34是最有力的分子。额外中心体的分簇多中心体细胞有丝分裂失败的原因和细胞死亡。最坚实的人力癌症有额外中心体的发生率较高。 PJ-34的活性共聚焦成像活的人乳腺癌MDA-MB-231细胞转染载体编码荧光γ-微管蛋白，这是非常丰富的中心体和荧光蛋白H2B目前在实时记录染色体。转染与PJ-34处理后的MDA-MB-231细胞中检测到异常的染色体安排和γ-微管蛋白聚集疫源代表declustered中心体。非集群额外两个纺锤体两极的中心体细胞死亡之前。这些结果与FOr的第一次检测独家额外中心体的聚类在有丝分裂，有丝分裂失败导致细胞死亡在人类癌细胞中的PJ-34的细胞毒活性。根据以前的研究结果固定细胞共聚焦成像，PJ-34独家消灭癌细胞的多中心体，而不损害正​​常细胞发生有丝分裂，两个中心和双焦主轴的观察。这PJ-34的细胞毒活性不共享等烈性PARP1抑制剂，观察，表明其独立性PARP1抑制PARP1缺失的MEF窝藏extracentrosomes。现场共聚焦成像提供了一个有用的工具，用于识别新的分子，消除细胞在有丝分裂过程中。

PJ-34是一种稳定的水溶性菲啶1（ 图1）。我们先前的研究发现细胞死亡和集群额外中心体在几种类型的固定的多中心体肿瘤细胞，分别用PJ-34。相比之下，正常增殖细胞没有受损2,3。针对centrine1在固 ​​定的额外中心体细胞2和γ-微管蛋白的抗体双标记进行鉴定中心体。 在这里，记录在这些现场额外中心体细胞的杀伤活性PJ-34实时通过现场...

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Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

菲PJ-34在肿瘤细胞进行有丝分裂的细胞毒活性，实时记录现场共聚焦成像。 PJ-34根除人类乳腺癌MDA-MB-231细胞有丝分裂窝藏额外中心体。额外中心体不像正常的双向焦点有丝分裂，不聚集在两个纺锤体的两极存在的PJ-34。

共聚焦成像在肝癌细胞中观察到的异常有丝分裂细胞死亡相关

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

cell-death-associated-with-abnormal-mitosis-observed-confocal-imaging

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14.8K 次观看.  Sheba Medical Center. 菲PJ-34在肿瘤细胞进行有丝分裂的细胞毒活性，实时记录现场共聚焦成像。 PJ-34根除人类乳腺癌MDA-MB-231细胞有丝分裂窝藏额外中心体。额外中心体不像正常的双向焦点有丝分裂，不聚集在两个纺锤体的两极存在的PJ-34。