我们要感谢马蒂亚斯S.迪克，罗兰F.德雷尔和塞巴斯蒂安鲁尔讨论。这项工作是由一个SNSF​​教授PP00P3_139120 / 1和巴塞尔大学的项目赠款ID2153162到PB支持

1.毛地黄皂苷测定与mCherry表达沙门氏菌 （基于FACS分析） <ol><li>准备细菌 注意： 沙门氏菌野生型SL1344（链霉素抗性）从质粒（PFPV编码mCherry下rpsM启动子）表达mCherry用于该测定。细菌吞噬作用和增殖，其中通过mCherry的组成型表达没有改变（数据未示出）16。 <ol><li>在3ml LB培养基，在37℃的CO / N的一摇床补充有链霉素（90微克/ ml）和氨苄青霉素（100微克/毫升，mCherry表达载体）感染前接种菌株1天。 </li></ol></li><li>电镀细胞感染。 <ol><li>在24孔板/孔在1ml初级巨噬细胞培养基中的种子的野生型BMDMs在1.25×10 5个细胞的密度（DMEM补充有10％胎牛血清（FCS，热灭活，56℃，30分钟），1％HEPES，1％非必需氨基酸（NEAA）中，1％L-谷氨酰胺和10％的L929上清液（来自巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF的条件培养基）的制造的L929细胞）。根据表1种子井占个体条件。加盖玻片用作对照（ 表1）的孔中。 </li><li>过夜孵育细胞在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2">透</td><td colspan="3">染色</td></tr><tr><td></td><td>玻璃盖玻片</td><td>沙门氏菌</td><td>洋地黄</td><td>皂素</td><td>抗沙门氏菌</td><td>抗钙联接蛋白</td><td>抗PDI </td></tr><tr><td> A1（样品） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2（样品） </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3（样品） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4（不透控制） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5（完全通透控制） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1（染色钙联接） </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2（染色钙联接） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3（染色钙联接） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1（染色对于PDI） </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2（染色的PDI） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3（染色的PDI） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 表1：在24孔格式进行后续感染沙门氏菌，透化和染色骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）电镀方案 *根据方案1或方案2是否完成。 <ol start="3"><li>准备细菌感染。 <ol><li>第二天，通过在PBS中稀释的培养1:10，测量OD 600针对PBS仅控制确定沙门氏菌的过夜培养的浓度。这确保了OD 600测量在升inear范围分光光度计。 </li><li>计算每毫升沙门氏菌的浓度。 1-3的OD 600相当于1×10 9个细菌。 </li><li>稀的细菌在巨噬细胞培养基中以达到1.25×10 6个细胞/ ml的沙门氏菌浓度。 </li></ol></li><li>感染细胞与沙门氏菌 。 <ol><li>从BMDMs移除介质。加入1毫升的巨噬细胞培养基中，以未感染的对照孔（B1〜B3，C1〜C3）。加入1毫升沙门氏菌悬浮液至孔A1 - A5至达到每个细胞10细菌感染（MOI）的多重性。 </li><li>离心板15分钟，300×g离心，在37℃以同步感染。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>杀死沙门氏菌外与庆大霉素。 <ol><li>在1小时感染后，从孵化器中取出板，并添加0.1毫升巨噬细胞培养基中含有0.1毫克/毫升庆大霉素杀死细菌细胞外。添加庆大霉素到所有孔中，甚至对未感染的对照，以确保所有的细胞相同的方式处理。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>洗涤细胞。 <ol><li>在2小时后感染，从孵化器中取出板和洗涤各孔2×1毫升纯DMEM中（预热至37℃），并将其与巨噬细胞的培养基更换（预热至37℃）含有10微克/毫升&#160;庆大霉素防止任何剩余胞外细菌的生长。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>准备新鲜的缓冲液用清洁剂和抗体。 <ol><li>刚分析的所需时间点之前，准备毛地黄皂苷的新鲜储备液以1mg / ml，在KHM缓冲液（110毫乙酸钾，20mM的HEPES，2mM的MgCl 2的，pH为7.3）。筛选股票，并在稀释缓冲KHM到工作浓度的毛地黄皂苷的50微克/毫升。另外，制备0.1％皂苷中KHM缓冲液，抗沙门氏菌抗体偶联到FITC（CSA-1-FITC）在1/500，抗钙联接蛋白在1/100或抗PDI在1/100 KHM溶液缓冲补充有3％BSA封闭。 </li></ol></li><li>细胞透。 <ol><li>从培养箱中取出盘子并洗孔3×用0.5ml KHM缓冲液（预热至37℃）。除去KHM缓冲器和与毛地黄皂苷添加0.25毫升平原KHM缓冲区到井A4和B1 / C1，KHM缓冲区到井A1 - A3和B2 / C2或KHM缓冲器，具有皂素孔A5和B3 / C3（根据表1）。孵育正好1分钟，RT和立即清洗各孔3×用0.5ml KHM缓冲液（预热至37℃）。 </li></ol></li><li>初级抗体染色。 <ol><li>除去KHM缓冲器和添加第一抗体溶液（山羊抗沙门氏菌 -FITC，250微升/孔，0.1微克/毫升），以适当的孔（ 图1 </st荣&gt;， 表1）。孵育板15分钟在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li><li>洗涤细胞1X用1毫升的PBS。 </li></ol></li><li>感染的细胞（井A1 - A5）：FACS分析<ol><li>洗涤细胞3倍，用PBS，并添加0.5毫升冰冷PBS含有0.1％的Triton。转移到5毫升FACS管细胞滤网盖，打破了细胞聚集。不断的冰样本。 </li><li>分析流式细胞仪的样本。使用完全透控件，设置为基于前向总细菌和侧向散射（FSC / SSC）第一栅极，而所述mCherry信号（610毫微米±20nm的过滤器）。 </li><li>接着，分析在细菌总人口使用完全透和不透的控制来设置门，用于胞浆菌素（FITC + mCherry +）和液泡菌（FITC-，mCherry +）（ 图3）的FITC信号。 </li><li>与门设置，分析样品，并确定胞质对的百分比根据制造商的协议使用的FlowJo软件液泡细菌。 </li></ol></li><li>未感染的通透性控制（井B1 - B3，C1 - C3）：镜<ol><li>固定术<ol><li>除去PBS中并在PBS中加入250微升的PFA 4％。孵育10分钟，在37℃。 </li><li>洗孔2×1毫升PBS中，并加入250微升的0.1M甘氨酸的PBS 10分钟以淬灭固定液。洗井2×1毫升的PBS。 </li></ol></li><li>二级抗体染色。 <ol><li> 1小时在室温下与连接到荧光团在PBS中适当的二级抗体染色透控制补充有0.1％皂苷和3％的BSA，充分透细胞。 </li><li>洗涤盖玻片3次用1毫升的PBS并装入盖玻片分析在安装介质用DAPI（1.5微克/毫升）。 </li></ol></li><li>显微镜分析。 <ol><li>使用共聚焦FLUO在40X或63X放大率分析与对照的盖玻片rescence显微镜。如果透工作过，应该没有染色用于非渗透细胞，钙联接蛋白染色为digitonin-和皂苷透化细胞，并只PDI染色为皂苷透化细胞（ 图4）。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.毛地黄皂苷含量与未标记沙门氏菌（显微镜为基础的分析） <ol><li>准备细菌O / N培养。 <ol><li>接种未标记沙门氏菌野生型SL1344（链霉素抗性）1天在3ml LB培养基，在37℃的CO / N的一摇床补充有链霉素（90微克/毫升）的感染之前。 </li><li>电镀细胞感染。 <ol><li>在24孔板含有无菌盖玻片在1.25×10 5个细胞的密度种子BMDMs /孔在1ml巨噬细胞培养基（DMEM补充有10％胎牛血清（FCS，去补充，56℃，30分钟），1％HEPES，1％L-非必需氨基酸（NEAA），1％L-谷氨酰胺和10％的L929上清液）。根据表1种子井占个体条件。 </li><li>孵育细胞O / N中的培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>准备细菌感染。 <ol><li>第二天，通过在PBS中稀释的培养1:10并测量OD 600针对PBS仅控制确定在O / N培养沙门氏菌的浓度。这确保了OD 600测量在分光光度计线性范围。 </li><li>确定每毫升沙门氏菌的浓度。的1的OD 600相当于1×10 9个细菌。 </li><li>稀的细菌在巨噬细胞培养基中以达到1.25×10 6个细胞/ ml的沙门氏菌浓度。 </li></ol></li><li>感染细胞与沙门氏菌 。 <o升&gt; <li>从所有孔中取出。加入1毫升纯巨噬细胞中到未感染对照孔（B1 - B3，C1 - C3）。加入1毫升沙门氏菌悬浮液至孔A1 - A5至达到每个细胞10细菌感染（MOI）的多重性。 </li><li>离心板15分钟，300×g离心，在37℃以同步感染。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>杀死沙门氏菌外与庆大霉素。 <ol><li>在1小时感染后，从孵化器中取出板，并添加0.1毫升巨噬细胞培养基中含有1mg / ml的庆大霉素，以杀死胞外细菌到所有孔中。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>洗涤细胞。 <ol><li>在2小时后感染，从孵化器中取出板和洗各孔3次用1毫升含有10微克/毫升新鲜的巨噬细胞培养基 庆大霉素防止生长的任何剩余的胞外细菌。传送板在培养箱中在37℃和5％的CO 2。 </li></ol></li><li>准备新鲜的缓冲液用清洁剂和抗体。 <ol><li>刚分析的所需时间点之前，准备毛地黄皂苷的新鲜储备液以1mg / ml，在KHM缓冲液（110毫乙酸钾，20mM的HEPES，2mM的MgCl 2的，pH为7.3）。过滤库存和KHM缓冲稀释至50微克/ ml的工作浓度 毛地黄的。 </li><li>另外，制备0.1％皂苷中KHM缓冲的溶液中，抗沙门氏菌 -FITC（CSA-1，0.1微克/毫升），在KHM缓冲器抗钙联接蛋白在1/100或抗PDI在1/100补充有的3％BSA（见材料表用于抗体浓度）。 </li></ol></li><li>细胞透。 <ol><li>从培养箱中取出盘子并洗孔3×用0.5ml KHM缓冲液（预热至37℃）。删除KHM缓冲区，并添加0.25毫升平原KHM缓冲区井A4和B1 / C1，KHM缓冲器，具有毛地黄皂苷井A1 - A3和B2 / C2或KHM缓冲器，具有皂素井A5和B3 / C3（根据表1）。孵育正好1分钟，RT和立即清洗各孔3×用0.5ml KHM缓冲液（预热至37℃）。 </li></ol></li><li>初级抗体染色。 <ol><li>除去KHM缓冲器和添加第一抗体溶液（山羊抗沙门氏菌 CSA1-FITC，250微升/孔，0.1微克/毫升），以适当的孔（ 图2，表1）。孵育板15分钟在培养箱中在37℃和5％的CO 2。洗3次用1毫升的PBS。 </li></ol></li><li>固定。 <ol><li>除去PBS中并在PBS中加入250微升的PFA 4％。孵育10分钟，在37℃。 </li><li>洗孔2×1毫升PBS中，并加入250微升的0.1M甘氨酸的PBS 10分钟以淬灭固定液。洗井2×1毫升的PBS。 </li></ol></li><li>总受感染的样本沙门氏菌污染。 <ol><li>洗涤盖玻片3次用PBS用0.1％皂苷/ 3％BSA和孵育的样品与抗CSA1抗体（山羊抗CSA1，0.1微克/毫升，小鼠抗LPS作品以及0.1微克/毫升）1小时在室温在PBS 0.1％皂苷/ 3％BSA封闭。 </li><li>洗3次在PBS与0.1％皂苷/ 3％BSA封闭。孵育的样品与第二抗山羊抗体耦合到所选择的荧光团在PBS与0.1％皂苷/ 3％BSA在室温30分钟在黑暗中。 </li><li>洗涤盖玻片3次用1毫升的PBS并装入盖玻片分析在安装介质用DAPI（1.5微克/毫升）。 </li></ol></li><li>显微镜分析。 <ol><li>通过计数胞质沙门氏菌 （抗沙门氏菌 -FITC阳性）和总沙门氏菌 （双阳性）（ 图5）获得了共焦显微镜的数据。通透的控制应该显示：无染色无渗透细胞，钙联接s泰宁为毛地黄皂苷透化细胞和PDI染色皂苷透化细胞（ 图4）。韦尔斯A4和A5将作为内部控制的沙门氏菌污染。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leading+a+sheltered+life:+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments.">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li><li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression.">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li><li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole.">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li><li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication.">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li><li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens.">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li><li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11:+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock.">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy.">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole.">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li><li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells:+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication.">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732 (2012).</li><li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+(IRG+proteins)+triggers+necrotic+cell+death.">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).</li><li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases.">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii.">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li><li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+guanylate+binding+protein+2+(mGBP2)+controls+Toxoplasma+gondii+replication.">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf.">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li><li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells.">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681 (2014).</li><li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac/DIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling.">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298 (2012).</li><li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein.">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens.">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

差透是一个简单而可靠的方法来分析和量化的液泡车厢和细胞质的细菌性病原体的亚细胞分布。相同的测定已被成功地用于与细菌，如弗朗西斯novicida 2,4和志贺氏菌 12。然而，由于许多细胞内病原体改变或修改主机内膜结构，毛地黄皂苷透化的鲁棒性将必须在个体基础上确定。在对于所用可能是必要的病原体或细胞系微调该测定的。该测定不仅限于感染生物学，但也...

细胞内细菌病原体复制或者直接在宿主细胞胞质溶胶，或者在专门的液泡区室1。在感染的初始阶段大多数病原体获得通过吞噬​​作用由专门的细胞（如巨噬细胞），或通过积极推动自身摄取进入非吞噬细胞内化两种。在吞噬细胞，吞噬体通常与溶酶体融合，以形成降解隔室，其中所述吞噬颗粒被消化。专门胞浆菌，如弗朗西斯novicida或志贺氏菌 ，逃避吞噬体降解通过诱导吞噬体的破裂和随后逃逸进入细胞质2,3。这需要毒力相关的机制，如弗朗西斯致病岛（FPI）或痢疾杆菌 T3SS，其中注入效应蛋白促进液泡破裂2-4。宿主细胞细胞质的功能一些保守模式识别受体，通常承认的病原体的存在和诱导先 ​​天免疫信号5。此外，xenophagy，自噬的抗微生物形式能降解该进入细胞质细菌。胞浆菌通常很好地适应生硬或采用不同的策略规避这些反应。例如， 弗朗西斯修改其LPS以避免主机识别和志贺防止自噬招聘使用分泌效应蛋白6,7。 另一种策略逃脱溶酶体降解由模型液泡病原体沙门伤寒采用，此后简称为鼠伤寒沙门氏菌 。 沙门氏菌使用T3SS注入该重塑的初始吞噬体进入细胞内利基效应， 沙门氏菌含液泡（SCV） 8,9。连续操纵宿主的途径是要保持这种空泡招募脂类等营养物质到液泡。事实上， 沙门氏菌的SIFA突变体不能维持液泡稳定，并进入宿主细胞后数小时内细胞质感染后，这导致活化先天免疫途径和自噬招募8。 沙门氏菌的液泡逃逸取决于细胞类型即研究，一些报告显示，在上皮细胞中甚至WT 沙门氏菌能逃脱SCV和hyperreplicate在细胞质10。最近的报告表明，先天免疫检测的病原体空泡也取决于主机的认可和破坏含病原体的空泡（PCVs）11-14能力。 鉴于这两个主机或细菌基因型可影响空泡和细胞内室之间的胞内细菌的分布，有必要进行量化空泡对的数目胞浆菌。因为，在大多数实验设置宿主细胞感染有一个以上的细菌，并随后可以在不同的亚细胞区室怀有几个细菌，一种技术是必要的，它允许量化在单细菌的水平。通透性差（也称为吞噬体保护法）提供了这一决议2,4,10,12。该测定法是基于宿主细胞质膜与洗涤剂毛地黄皂苷，这让液泡膜完好的选择性透和因此允许胞浆菌的抗体的选择性染色。在这里，我们提供了两种协议的使用差分通透性胞浆空泡和鼠伤寒沙门氏菌的定量。这个方法的原理在图1中被描述：骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）感染固定相mCherry表达沙门氏菌 。固定相沙门氏菌需要牛逼ø被使用，因为它们下调的SPI-1 T3SS，其活性将另外由NLRC4炎性被识别，诱导BMDMs 15的快速细胞死亡（pyroptosis）的表达。以下洗涤细胞并用毛地黄皂苷50μg/ ml的1分钟处理过的感染。将细胞立即再次洗涤和温育与耦合到FITC与访问到细胞质标记细菌的抗沙门氏菌抗体。后的附加洗涤步骤细胞裂解和mCherry +（液泡）和FITC + / mCherry +（细胞质）的细菌的百分比是通过FACS测定。我们还报告这种方法，可用于在没有荧光蛋白表达菌株是可用的（ 图2）的适应。附加步骤的FITC标记，其中将细胞固定并完全透后进行了介绍。此后所有的细菌都沾满抗沙门氏菌抗体和相应的二次抗体。 DET挠度然后通过显微镜代替FACS分析进行。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

细胞内细菌病原体可在细胞质或专门含病原体的空泡（PCVs）复制。到达细胞质，像痢疾杆菌和弗朗西斯novicida细菌需要诱导吞噬体破裂。与此相反， 鼠伤寒沙门氏菌复制在液泡室，被称为沙门氏菌含液泡（SCV）。 沙门氏菌然而某些突变体不能维持SCV完整性并因此释放到胞质溶胶中。胞质与单菌的水平液泡细菌的百分比可以通过差通透性进行测量，也被称为吞噬体的保护测定法。该方法利用洗涤剂毛地黄皂苷的财产选择性结合胆固醇。由于质膜包含比其它细胞膜更胆固醇，毛地黄皂苷可用于选择性地透质膜同时留下细胞内膜完好。简言之，感染后表达的荧光标记蛋白（ 例如 mCherry等等）的病原体，宿主细胞的质膜透化与含有缓冲液短暂孵育毛地黄皂苷。然后将细胞洗涤并孵育一抗（偶联至所选择的荧光团）针对所选择的细菌（ 例如抗沙门氏菌 -FITC），并再次洗涤。如果未标记的细菌时，额外的步骤可以做到的，其中所有的膜透化和所有细菌染色与相应的抗体。以下染色，空泡和细胞内细菌的百分比可以通过FACS或显微镜来量化通过计数单或双阳性事件。在这里，我们提供了实验细节使用这种技术与细菌鼠伤寒沙门氏菌 。该测定的优点在于，相对于其他测定法，它提供了一个量化单bacte的水平河口，如果通过显微镜分析提供胞质和液泡细菌在给定的细胞的精确数量。

图1和图2显示的毛地黄皂苷测定在方案1和方案2示出在协议的关键步骤和所获得的结果中描述的原理图; 图3示出了典型的FACS结果。阳性和阴性对照用于设置的闸门的mCherry + / FITC-菌（液泡沙门氏菌 ）和mCherry + / FITC +菌（细胞质沙门氏菌 ）。基于这些门胞质和液泡细菌的百分比可以在实验样本中确定。在这个例子中，我们比较了野生型和ΔsifA 沙门氏菌 。 ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization at JoVE.com

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

胞浆的定量与液泡<em&gt;沙门氏菌</em&gt;在原发性巨噬细胞差透

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K 次观看.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.