原代人细胞中寨卡病毒抗体依赖性增强的定量研究

该方法可用于评估登革热病毒的原发免疫对寨卡病毒感染的影响，使用实际的人类患者血清和原发性人体免疫细胞。使用实际的人类患者血清样本和人原细胞，通过免疫前血清和抗体，更深入地了解寨卡病毒的抗体依赖性增强。这种方法提供了对患者血液中抗体增强其他人类细胞中病毒感染的能力的洞察。

重要的是要确保病毒感染水平足够高，足以检测，但足够低，不压倒细胞或干扰数据解释。首先在无菌、平底96井的盘子里，每井100微升细胞培养中播种三倍十至第四细胞。当所有细胞都镀上时，将板放在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中，并在无血清介质中连续稀释10倍的解冻人体血清样本。

在将稀释添加到病毒溶液和细胞之前，请确保所有免疫前血清的血清稀释和稀释因子保持不变。接下来，在37摄氏度的水浴中解冻寨卡病毒株，在一到两分钟内将库存迅速转移到冰中。将寨卡病毒的感染等效量 0.1 倍数添加到血清等分中，并将板放在细胞培养箱中一小时，使登革热病毒抗体与 Zika 病毒形成复合物。

在孵化结束时，用每井100微升PBS洗涤细胞，并在每井中加入50微升的免疫复合物。经过两个小时的孵育，取出介质，用每井100微升PBS洗两次，以完全去除免疫复合物和任何未附着的病毒。然后给细胞喂100微升，每井细胞培养，辅以10%的胎儿牛血清。

然后将细胞返回到细胞培养箱48小时。感染后两天，用每口100微升无菌PBS洗两次细胞，然后向每口井添加250微升细胞解液缓冲液，每口井中加入10%β汞醇。通过刮擦上下移液至少五次，以加快分解过程，将细胞解液转移到无菌标记的 1.5 毫升管中。

在每个管中加入70%乙醇的等量，并移液，上下四到五次。当利沙酸盐悬浮液清晰时，将每个溶液转移到两毫升收集管中标记的二氧化硅柱中进行离心。丢弃流式保持同一收集管中的柱，并将 700 微升的洗涤缓冲液 1 添加到每列进行第二次离心。

丢弃流式处理后，使用每次洗涤两次的 500 微升洗涤缓冲液再次冲洗柱子。第二次洗涤后，将柱转移到新的两毫升收集管中，进行另一次离心。将 30 微升 42 摄氏度无 RNase 水添加到每个柱的中心进行离心并回收洗净的 RNA。

对于定量实时聚合酶链反应或QRTPCR分析，从10微摩尔库存中加入一个基因特异性前进和反向质剂的微升，以及每反应0.25微升的逆转录酶混合物。请注意，识别寨卡病毒遗传物质的底材将检测病毒基因并允许感染定量。接下来，添加 12.5 微升的 SYBR 绿色混合，然后每次反应中加入 25 微升水，在每个 96 井 QPCR 板的井中加入 15 微升主混合。

使用主混合时，将 100 纳米RNA样品添加到混合中，并将主混合移液器放入 QRTPCR 板的单个孔中。请注意，样品应在同一 QRTPCR 板上以三次三次运行。然后根据表中概述的参数在定量 PCR 机器上运行样本。

单击系统软件中的熔体曲线选项卡以监视熔体曲线。熔体曲线将在特定基因的所有样本中显示单峰，以确认只有一个安培康的存在。为了获得最佳效果，在熔体曲线协议中，在步骤之间使用 0.5 摄氏度的温度增量和 10 秒的最小保持时间。

然后单击量化数据选项卡以获取每个样本的定量周期，然后将数据导出到电子表格中进行进一步的定量分析。人血清样本可分为三组：登革热病毒感染确认样本、登革热病毒抗体确认样本、无登革热病毒中和抗体或RNA的健康血清。经过48小时的感染，QRTPCR分析表明，大多数含有登革热病毒血清型的血清一至四抗体能够增强寨卡病毒在不同水平上的复制。

寨卡病毒滴答声增加率最高的是接受含有血清素的登革热病毒血清型2和4抗体治疗的巨噬细胞，而血清型1和3显示寨卡病毒的诱导相对较低。重要的是要保持无菌环境，穿适当的个人防护设备，并始终将解冻的病毒血清样本和QPCR试剂放在冰上。该协议可以很容易地修改，以研究抗体依赖增强的其他病毒，如黄热病病毒，登革热病毒，或西尼罗河病毒使用一组患者血清。

这项技术对于在arbo病毒或病毒学领域进行未来的抗体依赖性增强研究将非常有用。应时刻使用适当的生物安全二级个人防护设备，所有病毒废物应在处置前 10%漂白中除污染 30 分钟。