Name: microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院的资助 GM114854 (大法官) 和 CA211635 (大法官), 阿诺德和梅布尔贝克曼基金会贝克曼青年研究员补助金 (大法官), 杜邦青年教授奖 (大法官), 美国大众协会光谱研究奖 (对大法官) 和波斯菊俱乐部基础奖学金 (对 R.M.O. 和 E.P.P.)。本出版物所表达的意见和结论完全是作者的观点, 不一定代表资金来源的官方观点。

所有与维护和处理爪蟾有关的协议都是由乔治·华盛顿大学机构动物保育和使用委员会批准的 (IACUC 号。A311)。
1. 取样器具、介质、溶剂和取样盘的制备
<ol>
	<li>准备1x 斯坦伯格的溶液 (SS) 溶解在超纯水 (〜18.2 ω. cm 在25° c) 按以下顺序和在被表明的集中跟随一个标准协议33: 氯化钠 (58.2 毫米), 氯化钾 (0.67 毫米), 硝酸钙 (0.34 毫米), 硫酸镁 (0.83 毫米), 三盐酸盐 (4.19 毫米), 和三基 (0.66 毫米)。使 0.5x ss 由二倍, 和 0.1x ss 由十倍稀释, 1x ss 使用超纯水。</li>
	<li>先制作2% 琼脂糖, 然后在120° c 的温度为20分钟, 准备好取样盘。还有液体时, 用溶液将 60 mm 培养皿的底部涂上。一旦琼脂糖凝胶冷却和固化, 火焰的六英寸的巴斯德吸管结束, 直到它形成一个球, 轻轻触摸的加热结束, 以压印5-10 口井, 〜1毫米深, 进入琼脂糖。 注: 这些井用于在取样过程中固定胚胎。</li>
	<li>制备代谢物萃取溶剂。将溶剂的理化性质 (如: 如、极性和 pH) 调整到研究中感兴趣的分子类别。 注: 例如, 我们使用40% 甲醇和40% 乙腈在 LC-MS 级水中作为一种发现的方法, 主要针对极性代谢物, 和一些 apolar 代谢物和多肽28。</li>
	<li>使头发循环使用干净的头发和巴斯德吸管的描述, 在其他地方的33 , 轻轻移动的胚胎在培养皿的最小摄动。</li>
	<li>制造锥形尖端 micropipettes, 如图 1a所示。
	<ol>
		<li>首先, 将硼硅酸盐毛细管 (1000/500 µm 外/内直径) 置于燃烧棕色型毛细管拉拔器中, 其设置如下: 热 = 355;拉 = 65, 速度 = 80;时间 = 150。</li>
		<li>接下来, 脱离的尖端的拉微使用一对罚款锋利钳获得一个毛细管尖端外径的〜20µm. 在显微镜下执行这一步骤, 以帮助精确和重现性。 注: 带小尖端的毛细血管在粘性细胞质的吸入过程中容易堵塞。虽然毛细血管具有较大的尖端, 当然有助于避免堵塞和吸入更多的细胞的内容, 大口径毛细血管可能会提出挑战, 在取样的较小的细胞, 并可能损害细胞为后续取样。仔细调整的压力和时间的渴望可能部分缓解这些挑战。我们发现 micropipettes 与〜20µm 外径理想的工作在这里提出。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Microsampling 单细胞和代谢物的提取
<ol>
	<li>获得胚胎 (受精卵) 通过促性腺激素诱导的自然交配成人爪蟾或通过体外受精, 如在其他地方的协议33,34。 注意: 自然交配确保胚胎发育阶段交错, 而由体外受精获得的胚胎在供应方面更可靠。然而,体外受精需要牺牲成年雄性青蛙。</li>
	<li>新制备2% 半胱氨酸 dejellying 溶液, 将4克半胱氨酸溶解到200毫升的超纯水中, 滴用 10 N 氢氧化钠溶液将溶液调节到 pH 值8。</li>
	<li>取出在胚胎周围的果冻大衣, 因为他们开始切割成2细胞阶段如下: 让胚胎在 dejellying 溶液中休息2分钟, 然后轻轻地将它们旋转2分钟, 防止胚胎附着在收集表面菜.</li>
	<li>轻轻地将碟中的内容倒入一个干净的烧杯中, 然后从烧杯中迅速醒酒 dejellying 溶液。立即用 0.1x SS 盖住鸡蛋, 冲洗剩下的 dejellying 溶液, 轻轻地旋转, 然后醒酒溶液。重复这一步骤四次彻底清洗的胚胎。 注意: 将胚胎的暴露范围限制在 dejellying 溶液中4分钟, 以确保存活。清除果冻大衣的全面协议在其他地方都有33。</li>
	<li>在培养皿中将 dejellied 胚胎移植到 1x SS 中。为了减少板块内的拥挤, 每 100 mm 的100胚胎放置一盘33。 注: 含有胚胎的盘子可以在14-18 ° c 之间储存, 以减缓发育, 并在同一个父母交错发育阶段获得胚胎。关于生长和发育的温度依赖性的进一步指南发布在 Xenbase 和其他地方33,35,36,37。</li>
	<li>排序裂解胚胎在2细胞阶段成一个单独的菜, 其中定型色素沉着自信地标志着背腹轴, 参照建立的细胞命运图38,39,40。
	<ol>
		<li>确定正确的裂解胚胎, 确保第一个沟沟, 其中 demarks 正中平面, 两黑暗 (腹) 和轻度 (背) 色素动物极点, 使两个一半是镜像图像41。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在多轴微 (手动或遥控) 上安装一个捏造的微。将微连接到微量。</li>
	<li>用塑料转移吸管将5的8细胞胚胎吸入, 并将其转移到含有 0.5x SS 的取样盘中。</li></ol>使用发圈, 将胚胎放置在一个单独的井中, 并确保正确识别的感兴趣的细胞在一个90°的角度面对探针。 注: 在胚胎中根据色素沉着和位置识别细胞, 参照细胞命运图38,39,40。
	<li>在显微镜 (20-30X 放大倍数) 下工作时, 引导微的尖端进入活胚中的识别单细胞, 如图 1所示 (请参见 B 面板中单元格的取样点和 C 面板中的仪器)。</li>
	<li>通过使用微量 ("填充模式") 将负压脉冲应用于 microcapillary, 提取单元格内容的所需部分。 注: 例如, 我们通过将-30 psi 的3脉冲应用到毛细管上, 例行地从细胞中吸出 10-15 nL 体积。这整个步骤持续〜5秒的愿望30。</li>
	<li>轻轻缩回细胞的微探针, 并将其尖端转化为4µL 的代谢物萃取溶剂冷冻 (4 ° c) 的微米瓶。接下来, 应用 +80 psi 的压力浪涌 1 s 到毛细管使用的微量 (' 明确模式 '), 以排除吸入到溶剂。
	<ol>
		<li>紧密关闭小瓶, 以防止蒸发, 并将瓶子放回4° c 冰桶, 直到取样完成。将使用的微丢弃到锐器容器中, 以防止针刺危险。 注: 要确定吸气细胞的含量, 将吸入的油注入矿物油, 在那里获得球形的形状。这个球体的直径可以用显微镜来测量。计算吸气量: V = 4/3 π r3, 其中v是音量, r是球体的半径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>要再次取样相同的细胞或胚胎的其他细胞, 重复步骤 2.7-2.11 (图 1c)。为了避免在连续的抽样之间进行潜在的携带, 请使用新鲜的微来分析每个不同的细胞。</li>
	<li>一旦取样完成, 漩涡混合样品含有离心瓶为〜1分钟, 以加快提取代谢物, 然后离心在 8000 x g 5 分钟, 在4° c 的颗粒细胞碎片和其他微粒。</li>
	<li>在-20 ° c 的一天或-80 ° c 下, 将细胞提取物连同细胞碎片和沉淀材料储存在一起, 直至1月, 直到由 CE-ESI-质谱仪测量。</li>

3. CE-电喷雾-质谱测量
<ol>
	<li>CE-ESI-质谱的标准和解决方案的制定
	<ol>
		<li>制备由1% 甲酸在 LC 级水中组成的背景电解质。</li>
		<li>准备鞘液中含有50% 甲醇在 LC-MS 级水和0.1% 甲酸。</li>
		<li>在鞘液中制备 50 nM 乙酰胆碱溶液, 每日评估 CE-电喷雾-质谱系统的性能。</li>
		<li>准备150毫米氯化钠溶液作为质量校准标准为低m/z范围在正面离子方式。质量 (m/z) 的精度和 #60; 建议使用 10 ppm。按照质谱仪供应商的指示执行这一步骤。 注: 另一种方法是, 使用已知的m/z值的其他标准可以对质谱仪进行质量校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CE-ESI 平台的构建
	<ol>
		<li>构建一个能快速垂直平移的 CE 注塑平台, 可进行一级 microvial 和样品装载。有关平台的构造和操作, 请参阅参考31中的详细信息。</li>
		<li>按如下方式组装 CE-ESI 接口 (图 1c)。将电喷雾金属发射器 (130/260 µm 内/外直径和〜 35 mm 长度) 装入一个3端口的 T 型联合。通过电喷雾发射器将分离的 CE 毛细管 (40/105 µm 内/外直径和〜100厘米) 馈入, 使其能够凸出 ~ 40-100 µm 超出发射器尖端的距离。在显微镜下工作以帮助准确。<ol>
			<li>将鞘液毛细管 (75/360 µm 内/外径和 ~ 100 厘米长) 连接到剩余的端口以提供电喷雾溶液。使用适当的袖子和手指-拧紧连接, 以无泄漏操作的 CE-ESI 接口。有关此接口的程序集和 trouble-shooting 的详细信息, 请参阅以前的协议31,32 。 注: 毛细管尺寸影响信噪比 (S/N) 和间隔时间。例如, 窄孔和短毛细管使用更高的分离电压来促进快速分离42,43。此外, 根据研究中感兴趣的分子类型, 分离毛细管可以被涂敷以最小化/避免不需要的分子-毛细管壁相互作用44。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用一个板持有人, 安装 CE-ESI 接口到一个三轴的翻译阶段和位置的电喷雾发射器尖端〜2毫米从质谱仪孔 (图 1c)。</li>
		<li>为了清洁界面的成分, 通过电喷雾发射器在1µL/分钟和通过 CE 分离毛细管的方法, 通过提供喷雾液来冲洗。使用注射器泵以稳定的速度喂溶剂。</li>
		<li>通过将注射器连接到毛细管入口端, 在每次测量前冲洗 CE 分离毛细管。使用足够大的注射器, 以尽量减少灌装和启动溶剂供应线。 注: 实验通常使用1毫升气密注射器提供电喷雾鞘溶剂和500µL 注射器冲洗分离毛细管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CE-电喷雾-MS 平台的验证及代谢产物的测定 注: 本步骤的目的是在分析单细胞提取物之前, 每天确认 CE-ESI-MS 仪器的分析灵敏度。</li></ol>使用这里描述的 CE-ESI 平台, 我们可以在 60 amol 使用四极正交加速飞行时间质谱仪16来实现较低的检测限制。<ol>
		<li>在冲洗分离毛细管5分钟后, 将其入口转移到位于不锈钢小瓶中的该溶液中。</li>
		<li>将电喷雾发射器尖端〜2毫米从质谱仪孔和精细调整这个距离使用一个翻译阶段, 以产生在稳定的锥射流制度, 而监测喷雾使用显微镜 (参见参考文献31,45)。监测总离子电流 (TIC) 的稳定度为30-45 分钟, 以确保稳定运行。</li>
		<li>应用〜 20 kV 的小瓶通过逐步扩大潜力超过〜十五年代, 通常产生〜7.5 µA 电流横跨分离毛细管使用1% 甲酸作为。在每次测量前, 确保系统稳定, 通过监测 TIC 剖面为〜5-10 分钟, 然后逐步降低分离 (CE) 的潜力, 以 0 V (地面)。 注意: 为了半自动这个过程, 我们使用一个自定义的软件来远程控制 CE 高压电源31。如果 ce-esi-ms 平台不稳定, 请首先在 esi 模式下测试 ce-esi-ms 平台, 然后在其他地方31中推荐的 ce-esi 操作模式下, 仔细评估不稳定源。简单地, 在仅 ESI 模式下测试平台, 关闭 CE 高电压, 并在锥射流喷涂系统中监视 TIC 30 分钟。如有必要, 请按以下方法处理错误: (i) 检查连接是否有泄漏;(ii) 用水、异丙醇、水和甲醇清洁电喷雾发射器;(三) de-gas 溶剂;(iv) 在再次测试前, 将发射器冲洗25分钟。如果 ce-esi 平台在仅 esi 模式下稳定, 但在 ce 分离过程中变得不稳定, 请检查系统的焦耳加热和/或电解: (i) 冲洗分离毛细管与25分钟, 重复实验;(ii) 使用较低的分离电位维持线性欧姆响应 (即, 线性 CE 电流与分离电压曲线);(iii) 检查 CE 毛细管的潜在损害, 如裂纹, 必要时更换毛细管。</li>
		<li>分析〜 6 nL 的样品如下:<ol>
			<li>吸管1µL 的乙酰胆碱标准溶液进入注射瓶。</li>
			<li>将分离的毛细管从一小瓶转移到注射瓶中。</li>
			<li>在1s 中提起 CE 注塑阶段15厘米。</li>
			<li>举行的阶段上升为六十年代水力注入〜 6 nL 样品入分离毛细管。</li>
			<li>随后, 将舞台转换回起始水平 (与毛细管插座一致)。</li>
			<li>轻轻地将毛细管进气道端移到其上。</li>
			<li>紧接着, 加大了 CE 电压, 开始电泳分离。</li>
			<li>启动 MS 数据获取。 注: 系统性能可采用任何化学标准进行表征。单细胞 CE-ESI-ms 为乙酰胆碱、蛋氨酸和组氨酸16提供了低 10 nM (60 amol) 检测的下限。注入的音量 (V 注), 插入到 nL 中的毛细管中, 取决于在注射过程中的高度差 (H, 厘米), 密度 (ρ, g cm-3) 和粘度 (η, 千克 m-1s-1), 长度 (L, m) 和 CE 的半径 (r, µm)毛细管和注入持续时间 (t 注, s).此关系由以下公式表示, 其中g (m s-2) 是重力加速度: 
			<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56956/56956eq1v2.jpg"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>一旦检测到标准, 停止数据采集, 将分离电压逐步降低到0伏 (地面), 然后从孔口中检索到2厘米的发射器。在分析细胞提取物之前, 先将分离毛细管冲洗5分钟。</li>
		<li>通过重复步骤3.3 来测量 10 nL 的单细胞提取物. 1-3. 3.5 使用九十年代向水力注入样品。</li>
	</ol>
	
	<li>数据处理 注意: 数据处理的目的是识别和量化单个细胞间的化合物。单细胞 CE-ESI-ms 协议生成的窄 electropherographic 峰值的典型基宽为几秒钟。通过执行数据分析 semi-manually, 可以使用以下步骤找到分子特征 (唯一的m/z值和唯一的迁移时间)。在图 2a中, 有代表性的分离显示出选定的代谢产物。<ol>
		<li>批量校准原始数据文件后数据获取。 注意: 我们使用来自甲酸钠簇的信号, 在从样品中分离出丰富的钠离子时产生, 它们在细胞中是原生存在的, 或者从胚胎培养基中提取。这一步骤的目的是通过确保高质量 (m/z) 的准确度, 优选和 #60; 5 mDa, 或 #60; 10 ppm, 在m/z 50-1, 000 之间, 以增强代谢产物的识别。在这里, post 数据获取校准使得有可能定期获得质量精度和 #60; 1 mDa, 或 #60; 2 ppm, 用于m/z 50-500。</li>
		<li>使用处理脚本, 在检测到的质量范围内搜索分子特征。平均质量谱横跨每个峰值, 以确定准确质量, 并记下其相应的迁移时间。对于在m/z 50-500 范围内的质量代谢产物的鉴定, 使用 500 mDa 台阶窗口来监测具有 S/N 和 #62 的分子特征; 3。</li>
		<li>手动或自动将峰值区域 under-the-curve 为每个分子特征。所产生的面积值被用作代谢物丰度的量度。</li>
		<li>确定感兴趣的分子特征以高度信心如下 (参见图</li></ol></li>2b)。<ol>
			<li>首先, 将分子特征的精确质量与一个代谢物数据库 (例如, Metlin46和 HMDB47) 进行比较, 以 10 ppm 的精确度来获得假定的质量匹配列表。</li>
			<li>接下来, 通过比较它们从细胞提取物中获得的串联质谱和代谢数据库中可用的数据, 或者用相应的化学标准测量的串联质谱来评估这些质量匹配。</li>
			<li>最后, 通过将细胞提取物中记录的分子特征的迁移时间与相同的 CE-电喷雾-质谱仪分析的相关化学标准进行比较, 验证这些任务的有效性。 注意: 为了提高实验的吞吐量, 我们通常只识别在实验条件或细胞类型上有统计学差异的分子特征。有代表性的标识如图 2所示。为了识别具有高质量准确度的代谢产物, 我们建议每天对质谱仪进行外部校准, 在每次测量时使用内部标准进行 real-time 校准, 并/或外部质量校准每个测量建议使用文件数据获取 (例如, 用于甲酸钠簇)。</li>
		</ol>
		
		<li>为了比较单个细胞间的小分子生产, 在选择的离子 electropherograms (从台阶 3.4.3) 中使用峰值面积 under-the-curve 作为复合丰度的相对度量。 注意: 在我们的实验中, 使用了47的在线软件平台来执行后续数据分析的所有步骤, 包括以下步骤: i) 在每个 sample-set 的至少50% 中过滤分子特征 (例如, 单元格类型);二) 数据的正常化;统计 (例如, t测试) 和多元数据分析, 如主成分分析 (PCA) 和层次聚类分析 (HCA)。我们使用p和 #60; 0.05 (学生的t测试) 标记统计意义和折叠-变化≥1.5 注意生物学意义。</li>
		<li>为了确定一个小分子在单个细胞中的绝对浓度, 采用经典的校准方法 (例如, 外部校准或标准加法), 使用 under-the-curve 的化合物的峰值面积,16。</li>

作者没有什么可透露的。

微探针 CE-电喷雾-MS 能够直接表征的代谢物在单细胞的活, 自由发展的胚胎。该方法的核心是两个技术子组件, 即原位毛细管 microsampling 和高敏 CE-电喷雾-MS. 与全细胞解剖相比, 毛细管 microsampling 具有快速操作的优点 (几秒钟与5分钟比较/细胞通过解剖), 与复杂的三维胚胎形态学的相容性, 以及在发育后期形成的更小的细胞的延展性。与解剖不同的是, 微探针取样会使胚胎中的其他细胞保持完好, 以便随后进行分析。有趣的是, microsampled 细胞可以继续分裂, 提高细胞分化的长期研究的可能性.控制微探针的尖端大小的能力也允许探针的 CE-ESI-MS 作为一个多才多艺的工具, 研究代谢的作用, 在细胞和发展过程中使用其他模型生物体, 包括斑马鱼和老鼠。为了确保可信的结果, 至关重要的是, 这些细胞的利益是准确, 准确, 并始终如一地确定和取样。实验参数的抱负 (例如, 毛细管尺寸, 压力, 和时间) 可以量身定制的样本的一个理想的部分细胞。此外, 这是至关重要的固定胚胎, 以提高精确的目标细胞的利益, 这反过来又减少对胚胎的损害。在本协议中, 我们在琼脂糖涂层培养皿中创建了水井, 在取样过程中固定胚胎。根据我们的经验, 与钝尖相比, 带斜面的毛细管能确保细胞的损伤最小。进一步提高抽样和化学分析的吞吐量将使大量的细胞的特性, 从而增强统计分析, 以确定重要的代谢产物的基础细胞和发展过程。
CE-ESI-质谱的目的是使代谢的特性在跟踪级的灵敏度。CE 为其他常用的分离技术, 如纳米流液相色谱法或气相色谱法提供了互补的优势。CE 提供精致的分离效率, 以解决复杂的代谢。CE 的物理尺寸与单个细胞所产生的体积有限的样品是相容的。此外, 各种丰富的技术存在 CE (例如, 现场放大样品堆叠或动态 pH 结), 以 preconcentrate 的样本在柱上, 从而提高检测灵敏度。为了成功的研究, 应该每天的特征和验证 CE-ESI-MS 仪器。例如, 我们需要至少3的 60 amol 乙酰胆碱标准 (6 nL 50 nM 标准注射) 和重复性和 #60; 5% rsd 在分离 (迁移) 时间和 #60; 25% rsd 在量化基于峰值面积-under-the-curve选择-离子 electropherograms 为标准。跟踪灵敏检测和动态量化可方便使用 CE-ESI-MS6、16、25 , 对在单个单元格中跨越广泛浓度范围的各种代谢物 (和多肽) 进行测量。,31. 尽管我们例行检测到300种不同的正电荷代谢物信号, CE-MS 也与负电离模式48兼容, 从而增强了单细胞代谢的可检测部分的深度。
虽然x 蟾在创建此技术以研究开发方面提供了一些优势, 但微探针 CE-ESI-MS 也可能适用于其他类型的模型生物体。在爪中,色素沉着和细胞间的大小差异以及可重现的细胞命运图49使得有可能识别出具有已知组织命运的特定细胞。这反过来又打开了对整个细胞谱系的发现或有针对性的新陈代谢实验的大门, 因为细胞将不同的发展项目固化成分化。为了消除因细胞周期变化而产生的差异, 应允许胚胎在取样前完全分裂到下一阶段, 如其他地方50所示。微探针 CE-ESI-MS 适用于经典的胚胎操作或分子工具 (例如, 基因敲出/下), 以测试在选择细胞或细胞类型之间具有显著失调的小分子的发育意义.例如, 通过绿色荧光蛋白的表达, 单细胞代谢与细胞命运追踪的结合导致了代谢物的发现, 而这些物质在以前未知的发育影响16。
单细胞代谢研究要求仔细注意分析细节, 特别是在量化的情况下;我们的技术也不例外。理想情况下, 应仔细评估样品准备工作流程的每一步, 以尽量减少潜在的降解和/或失去内源性代谢物或对样品的污染。建议使用高纯度变性溶剂 (如、LC/MS 级)、酸或碱、低温 (〜4° c) 来抑制酶的活性, 并在仪器分析之前减轻/避免对样品的新陈代谢变化6,51. 基于甲醇和乙腈的简单有机溶液可以有效提取小极性代谢物28。当然, 针对特定种类的代谢物 (例如, apolar 化合物, 脂质) 的实验, 可以从预先提取萃取溶剂的成分中受益。例如, 我们最近证明, 使用多种类型的萃取溶剂可以提高单细胞代谢的覆盖率28。这些代谢产物的量化可以通过内部标准来促进, 如 isotopically 标记的代谢物, 这可能是在代谢产物提取过程中被刺进萃取液中。内部标准也有利于提取和测量步骤的质量保证, 从而有助于评价技术和系统的重现性和样品分析的回收。最后, 我们主张生物复制 (不同的细胞从不同的胚胎中吸气) 与每个细胞分析技术复制 (同一提取物多次), 以帮助统计能力和解释的结果。

对胚胎发育的全面了解需要描述在发展中生物体的每个细胞中所展现的所有分子变化。当下一代测序与分子放大, 使深度测量单细胞转录1在开发的系统2,3, 相当少是已知的套件较小的分子在单个胚胎细胞中产生, 包括蛋白质, 特别是代谢物 (分子质量和 #60; ~ 1500 Da)。对内在和外在事件的快速和动态的反应, 代谢充当细胞的分子状态的一个强有力的描述符。因此, 单细胞代谢提高了在早期胚胎中追踪细胞异质性的空间和时间发展的潜能, 并为功能研究寻找新的分子。然而, 如果没有分子放大器可供这些分子, 检测代谢要求特殊灵敏度使用质谱 (MS), 这是技术的选择代谢物分析。
单细胞 MS 是一种技术的集合, 具有足够的灵敏度来测量单个细胞中的代谢物 (见评论4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15。细胞的重现性取样和代谢物的有效提取对单细胞中代谢物的成功检测至关重要。从爪胚胎中识别出的细胞的全细胞解剖, 使小分子和多肽的表征成为了16。其他方法采用 micropipettes, 以样本的个别活细胞, 其次是检测使用电喷雾电离 (ESI) MS。例如, 代谢物被测量在植物或哺乳动物细胞由单细胞录影 MS17, 压力探针18, 选拔探针19和流体力量显微镜20, 在其他技术之中21, 22、23、24。此外, 化学分离之前, 电离到单细胞 MS 工作流有效地简化了代谢, 从而减轻了潜在的干扰, 在离子生成前检测。重要的是, 分离还提供了复合特定的信息, 以协助分子鉴定。毛细管电泳 (CE) 已被用来检测代谢物在单一解剖25,26或 microsampled27神经元, 捕获小分子表型之间的差异。最近, 我们调整了 CE 到 ESI 串联 MS, 以使从爪蟾16,28的早期胚胎中解剖的单个细胞中的数百种代谢物的微量检测。这些研究揭示了胚胎细胞在发育早期的惊人代谢差异, 并导致发现代谢物与以前未知的发育影响16。
在这里, 我们提供了一个协议, 使检测的代谢物的单细胞直接在活脊椎动物胚胎使用微探针单细胞 CE-ESI-MS29,30。所选择的模型生物体是8至32细胞的x 蟾胚, 虽然这种方法也适用于后期的发展阶段和其他类型的模型生物体。该协议使用高分辨率成像系统指导下的多轴平移控制的锐化毛细管, 以在形态复杂的发育中的胚胎中, 在原位检测到 10 nL 部分的识别细胞。这种微探针可伸缩到较小的细胞, 并在几秒钟内操作, 这是足够快跟踪胚胎细胞谱系。在提取的极性或 apolar 小分子, 如代谢物和多肽, 从收集样本的〜4-5 µL 萃取液, 10 nL 的结果提取是分析在一个 custom-built CE 平台联用的一个 ESI 质谱仪。CE-ESI-MS 平台的构建和运行建立在其他地方所描述的协议之上。31,32轴 CE-ESI 接口是按照其他地方的描述构造的。31此平台在锥喷喷涂系统中保持, 以实现跟踪级别的灵敏度, 并具有在4-5 日志顺序动态范围内进行量化的能力 (相对28、29、30或绝对16)。CE-ESI-MS 平台提供了一个 60 amol 下限检测与8% 相对标准偏差 (RSD) 在定量超过 10 nM 到1µM 为小分子16, 这是足以表征内源代谢物在十。蟾单元格。Microprobed 细胞在胚胎发育的过程中继续分裂30, 允许对细胞代谢进行时空解析分析。事实上, 单细胞 CE-ESI-ms 可以用来发现细胞之间的新陈代谢差异占据了背腹16,29, 动物植物性的16, 和左右28发展轴以及细胞在x 蟾30中, 从一个共同的祖细胞中形成神经组织命中注定的背世系。除了在x 蟾胚30的不同发育阶段对单个胚胎细胞之间的代谢差异进行查询外, 我们预计这里描述的协议适用于广泛的生物分子和单细胞 microsampled 从胚胎发育的不同阶段, 以及其他类型的细胞和模型生物体。此外, 微探针可以用于 microsampling, 而不同的平台与微小的样品相兼容, 可以用于生物分子的分离和/或表征。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for Embryo Culture Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Metabolite Extraction Solvents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solvents and Standards for CE-ESI-MS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formic acid (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS-grade)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholine chloride</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microprobe Fabrication Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillaries</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Corrosion resitant and autoclavable.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microprobe Sampling Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Should be vibrationally isolated.</td></tr><tr><td>Illuminator e.g. Goosenecks</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes (Plastic, disposable)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm and 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;CE-ESI-MS Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High voltage power supply</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.</td></tr><tr><td>Syringe pumps (2)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Stereomicroscope capable of 4.5&amp;times; magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.</td></tr><tr><td>XYZ translation stage</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage</td><td>Custom-built</td><td></td><td>This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6&amp;ndash;10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary</td></tr><tr><td>Stainless steel sample vials</td><td>Custom-built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel BGE vial</td><td>Custom-built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fused silica capillary (40 &amp;micro;m/105 &amp;micro;m ID/OD; 100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>Fused silica capillary (75 &amp;micro;m/360 &amp;micro;m ID/OD; 100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 &amp;micro;m ID/OD)</td><td>Hamilton Co.</td><td>21031A</td><td>For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.</td></tr><tr><td>Syringes (gas-tight): 500 - 1000 &amp;micro;L</td><td>Hamilton Co.</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Digital multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 117</td><td></td></tr><tr><td>High-resolution Mass Spectrometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td>Maxis Impact HD</td><td>High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI</td></tr><tr><td>Tunning mixture for mass spectrometer calibration</td><td>Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis ver. 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ancillary Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum concentrator capable of operation at 4&amp;ndash;10&amp;deg;C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Analytical microbalance (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-20 &amp;deg;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>Freezer (-80 &amp;deg;C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

microprobe capillary electrophoresis mass spectrometry for single-cell metabolomics in live frog (xenopus laevis) embryos

单个细胞中小分子的量化为更好地理解胚胎发育的基本过程提供了新的潜能。为了能够直接在活胚胎中进行单细胞调查, 需要新的分析方法, 特别是那些敏感、有选择性、定量、健壮和可伸缩的不同细胞大小。在这里, 我们提出了一个协议, 使原位分析在自由发展的南非爪蛙 (爪蟾) 的单个细胞中的新陈代谢, 这是细胞和发育生物学的一个强有力的模型。这种方法使用毛细管微探针从胚胎中的单个识别细胞中抽出一个定义的部分, 使相邻的细胞保持完好, 以便随后进行分析。通过对高分辨率串联质谱仪进行微尺度毛细管电泳 (CE-ESI) 界面的耦合, 分析采集的细胞含量。这种方法可扩展到不同的细胞大小和兼容的复杂的三维结构发育的胚胎。作为一个例子, 我们证明了微探针单细胞 CE-ESI-ms 能够阐明的新陈代谢细胞异质性, 展开作为祖细胞在胚胎发育过程中产生的后代。除了细胞和发育生物学之外, 这里所描述的单细胞分析协议也可以用于其他细胞大小、细胞类型或动物模型。

我们最近使用微探针单细胞 CE-ESI-MS 来表征在自由发展的爪蟾胚29,30中单个识别细胞的代谢物。微探针使快速 (〜5秒/细胞),原位的愿望 10 nL 从一个单独的细胞, 同一细胞的多重愿望, 或几个不同的细胞在相同或后期发展阶段的活胚 (图 1b)。吸气细胞的含量是用合适的溶剂提取的, 然后用 custom-built 的 CE-ESI 接口分离和电离, 并由 MS. 通常, 该方法产生 ~ 300 冗余代谢物信号 (去除同位素和簇峰) 从每个细胞。分离是在图 2a中选择分子的例子。我们确定了70种不同的信号, 作为小极性代谢物, 基于迁移时间和细胞提取信号的 ms/ms 碎裂模式, 与标准或串联质谱库相比。例如,图 2b显示了基于这些正交信息组合的组氨酸的自信标识。
微探针 CE-电喷雾-MS 允许量化的代谢差异之间的单个细胞。CE-ESI-MS 的定量重复性 8% RSD 的基础上 under-the-curve 峰地区在选定的离子 electropherograms16,30。通过微探针取样, 该技术重现性为 14% RSD30, 这足以查询细胞间代谢活性的差异, 以统计和生物学意义。例如,图 3显示了微生物 CE-ESI-ms 启用了原位微取样三背细胞类型 (图 3a)。此外, 定量元数据的 PCA 揭示代谢变化作为一个确定的祖细胞的8细胞胚胎 (见 D1R 细胞) 除以形成一个细胞克隆在16细胞 (见 D11R 细胞) 和32细胞 (D111R 细胞) 胚胎 (图 3b)。在图 3c中, 有代表性的趋势显示了选择代谢产物。随着细胞分裂, 乙酰胆碱等代谢产物的丰度下降, 而 trolamine 和精氨酸则显示出这些细胞类型的相反趋势。Trolamine 从 8-到16细胞胚的丰度下降, 然后在32细胞胚中富集, 而 Ser 精氨酸在32细胞胚减少之前, 通过增加到16细胞胚来描述相反的趋势。精氨酸在这些细胞阶段之间的丰度没有显著的变化。预期这些趋势将使人们更清楚地了解作为十蟾早期发展阶段基础的基本进程。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56956/56956fig1.jpg"> 
图 1:原位探针单细胞毛细管电泳 (CE) 质谱 (MS) 的实验工作流.(A) 预制 micropipettes (顶) 前和 (下) 裂解后的尖端, 以20µm 外径, 用于 microsampling。(B) 随着8细胞胚胎发育到16细胞阶段, Microsampled 细胞继续分裂, 为体内的研究打开了舞台。(C) 在8个细胞的爪蟾胚胎中使用探针 (µP) 对单个细胞进行了取样 (见 V1R 和 D1R 细胞), 细胞代谢产物的提取和分析使用 CE-MS. 比例条 = 250 µm (暗/灰色);10毫米 (白色)。钥匙: SP, 注射器泵。(与引用29,30的权限相适应的数字。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56956/56956fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56956/56956fig2.jpg"> 
图 2: 微探针单细胞铈-MS 能够对代谢物有信心的鉴定.(A) 代表电泳, 用于选择已识别的代谢产物。(B) 基于精确质量、迁移时间和碎片数据 (碰撞诱导离解) 对代谢物标准的比较, 确定组氨酸。关键: 1, 甲基组氨酸;2、homolysine;山姆, S-氨;Orn, 鸟氨酸;茶、三乙胺;汽车, 肉碱;AcCho, 乙酰胆碱;AcCar, acetylcarnitine;HPX, 嘌呤;GSH, 谷胱甘肽<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56956/56956fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56956/56956fig3.jpg"> 
图 3: 在x 蟾中形成背鳍的单个细胞之间的定量代谢差异.(A) 8 细胞胚的祖 D1R 细胞及其后代的光学图像, 16 细胞胚中的 D11R 细胞和32细胞胚中的 D111R 细胞。(B) 主要成分分析 (PCA) 的代谢产物在这三细胞类型中发现不同的代谢特征。每个数据点表示在技术复制 (连接点) 中测量的不同单元格 (参见数字)。椭圆标记95% 信心。(C) 方差分析和事后 Fisher 最不显著的判别分析揭示了细胞各阶段复杂的代谢趋势。对于方块图, 正方形是平均值, box 是 1 x 标准误差的平均值 (sem), 而晶须为 1.5 x 扫描电镜. 键: *p和 #60; 0.05;ns, 没有显著差异。缩放条形图 = 250 µm (根据引用30的权限改编的数字。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56956/56956fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

我们描述的步骤, 使快速的原位取样的一个小部分, 高精度和最小的入侵使用 capillary-based 微取样, 以促进化学表征的代谢活动的快照活胚胎使用 custom-built 单细胞毛细管电泳和质谱仪平台。

活蛙 (爪蟾) 胚胎单细胞代谢的微探针毛细管电泳质谱

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

microprobe-capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-for-single

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

19.9K 次观看.  George Washington University. 我们描述的步骤, 使快速的原位取样的一个小部分, 高精度和最小的入侵使用 capillary-based 微取样, 以促进化学表征的代谢活动的快照活胚胎使用 custom-built 单细胞毛细管电泳和质谱仪平台。

视频: Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

规模以上非靶向代谢组学剖析血清超高效液相色谱 - 质谱（UPLC-MS）

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

科研

化学

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

不相关的代谢组学，生物源使用超高效液相色谱 - 高分辨质谱（UPLC-HRMS）

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

一个集成拉曼光谱和质谱平台，用于研究单细胞药物接受、代谢和效果

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

生物化学

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

集成细胞操作平台与单悬架细胞中药物和代谢物质谱分析的单探针相结合

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

活细胞成像和胚胎上皮细胞的定量分析非洲爪蟾</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

生物学

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

使用自动高含量分析仪进行活细胞显微镜的果蝇胚胎制备和微注射

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

发育生物学

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

单探头的应用:根据环境条件质谱成像和单细胞分析

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

无细胞测定中使用<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;胚胎提取研究核的大小调节机制。

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

活蛙 (爪蟾) 胚胎单细胞代谢的微探针毛细管电泳质谱

摘要

探索更多视频

此视频中的章节

规模以上非靶向代谢组学剖析血清超高效液相色谱 - 质谱（UPLC-MS）

不相关的代谢组学，生物源使用超高效液相色谱 - 高分辨质谱（UPLC-HRMS）

一个集成拉曼光谱和质谱平台，用于研究单细胞药物接受、代谢和效果

集成细胞操作平台与单悬架细胞中药物和代谢物质谱分析的单探针相结合

活细胞成像和胚胎上皮细胞的定量分析非洲爪蟾

发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

使用自动高含量分析仪进行活细胞显微镜的果蝇胚胎制备和微注射

单探头的应用:根据环境条件质谱成像和单细胞分析

无细胞测定中使用

非洲爪蟾用于可视化动态细胞质组织的蛋提取物制备和实时成像方法

活蛙 (爪蟾) 胚胎单细胞代谢的微探针毛细管电泳质谱

摘要

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规模以上非靶向代谢组学剖析血清超高效液相色谱 - 质谱（UPLC-MS）

不相关的代谢组学，生物源使用超高效液相色谱 - 高分辨质谱（UPLC-HRMS）

一个集成拉曼光谱和质谱平台，用于研究单细胞药物接受、代谢和效果

集成细胞操作平台与单悬架细胞中药物和代谢物质谱分析的单探针相结合

活细胞成像和胚胎上皮细胞的定量分析非洲爪蟾

发育（青蛙）胚胎中的细胞谱系引导质谱蛋白质组学

使用自动高含量分析仪进行活细胞显微镜的果蝇胚胎制备和微注射

单探头的应用:根据环境条件质谱成像和单细胞分析

无细胞测定中使用

非洲爪蟾 用于可视化动态细胞质组织的蛋提取物制备和实时成像方法

非洲爪蟾用于可视化动态细胞质组织的蛋提取物制备和实时成像方法