我们开发了一种创新的代谢组学方法。我们将活细胞的钟楼光谱成像与单细胞质谱法相结合。我们的技术可以监测和预测单细胞对药物的代谢变化。
这为基础研究和工业界开辟了许多应用。我们的方法将单细胞分辨率添加到当前的药物评估技术中，这将极大地帮助未来的药物发现工作。我们的技术也可以帮助我们了解细胞异质性在抗癌能力中的作用。
单细胞采样和数据分析是本实验中最具挑战性的方面。我们目前正在执行这两个步骤的自动化，尤其是采样部分。我们建议您在实验前很好地练习单单元采样，因为每个微操纵器设置略有不同，您应该花时间熟悉控件。
孵育细胞达到70%的汇合后，在适当的培养基中培养感兴趣的细胞，加入青霉素-链霉素以避免污染。在血细胞计上测量细胞密度后，亚培养细胞进入35毫米玻璃底部栅格盘或石英滑梯，在播种密度为0.7倍至第六位时使用相同的介质。然后在37摄氏度下孵育24小时。
第二天，细胞达到50至60%的汇合，用预热PBS缓冲液在37摄氏度下两次清洗细胞。在35毫米培养皿中将细胞分成经过药物治疗和未经治疗的亚群。将溶解在二甲基硫化物中的塔莫西芬与培养基混合，获得两毫升的最终体积和10微摩尔的塔莫西芬浓度。
这是药物治疗组。将相应的 DMSO 体积混合到介质中，作为对照组，以研究 DMSO 的影响。在光谱测量之前，在两毫升的尖峰介质中孵育两组，达到70%至80%的汇合，使用目标验证针孔和激光位置匹配。
要在每个实验之前校准分光光度计，将乙醇放在玻璃底盘中，以给定激光强度测量光谱一秒钟，并将峰值与已知波长关联。然后在5%的二氧化碳和37摄氏度下设置微型腔室。一旦显微镜系统准备就绪，从培养箱中取出细胞，并立即在37摄氏度的温水PBS缓冲液中冲洗细胞两次。
然后加入两毫升加热的PBS或氟布里特DMEM。在水浸式客观透镜上加入10微升水。并巧妙地将玻璃底部细胞盘放在显微镜舞台上。
将细胞采样系统固定到拉曼显微镜上。将 3D 微操纵器连接到连接到空注射器的玻璃毛细管支架上，以便吸吸样品。将显微镜设置为 40 倍的高放大场，以观察玻璃毛细管的尖端，并确保其未损坏。
使用微操纵器控制玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视野中。然后将毛细管向上移动 Z 轴，以稍后为培养皿提供间隙。
将样品盘放在显微镜的舞台上，调整放大倍数和焦点，选择网格盘上的目标细胞，然后移动到视图中心。通过聚焦激光线测量每个电池。每个单元的 15 秒暴露时间足以获得具有清晰拉曼信号的细胞的横截面。
电镀镜允许几十分钟内扫描一个细胞或一组细胞。然后使用微操纵器小心地降低玻璃毛细管，直到尖端聚焦。在微观观察下，用毛细管尖端触摸目标单细胞。
然后开始使用注射器施加负压，将细胞困在毛细管尖端内。通过拍摄视频来精确检查单元格的计时和吸盘位置，记录此过程。在 Z 轴上向上移动毛细管。
然后使用钳子将毛细管从毛细管支架上分离，以准备质谱分析。在设置质谱仪并分析介质后，在含有该细胞的毛细管中加入两个电离溶剂微升。将毛细管固定到连接到合适质谱仪的纳米电喷雾适配器上，然后开始自动采集方法。
此处显示了每种疾病的平均光谱，有和没有药物治疗。这两个条件的平均光谱在不同峰值时明显不同。特别是，1000厘米的峰值，这是苯丙氨酸和酪氨酸等芳香化合物的一个标志，表现出强烈的差异。
基于对潜在结构模型的投影，计算了表示波长在区分实验条件中的重要性的VIP分数。重要的是，VIP 配置文件的最高峰值对应于拉曼峰值，在拉曼峰值中，两种处理之间存在强烈差异。这证实了治疗细胞和未经治疗的细胞之间的特定分子差异。
在阳性鉴定后，在每个细胞中测量药物及其代谢物的相对丰度，并与未经治疗的细胞的背景峰值进行比较。在塔莫西芬丰度中观察到了强烈的变异。这种现象在代谢物4-羟基-塔莫西芬的情况下更为明显。
研究人员可以有兴趣探索光谱图像和细胞的代谢特征之间的联系。我们的研究也有工业应用，因为它允许对药物制造的细胞进行局部筛选。在准备电离溶剂进行质谱仪测量时，必须小心。
它应该在烟罩下准备。此外，注意不要触摸质谱仪仪的离子源，以免触电。最后，在整个测量过程中使用的采样毛细血管非常锋利，因此请小心处理，以免受伤。
