这项研究得到了伦敦国王学院的支持, 并获得英国大学的综合癌症影像中心的资助, 由癌症研究和 EPSRC 与湄公河和卫生部 (英国) 联合提供资金;美国国立卫生研究院 (NIHR) 生物医学研究中心, 总部设在男、圣托马斯的 NHS 基金会信托和伦敦国王学院;由威康信托基金和 EPSRC 资助的医疗工程卓越中心, 拨款数量 088641/z/09/z;一项癌症研究英国多学科项目奖给 GOF 和 PJB, 并且国王的健康伙伴授予 GOF。nanoPET/ct 和 nanoSPECT/ct 扫描仪是购买和维护的设备赠款从威康信托基金。所表达的观点是作者的意见, 不一定是 NHS、NIHR 或卫生署。

本议定书符合联合王国 (联合王国) 立法和当地道德审查小组规定的所有要求。在遵守本议定书时, 确保程序也符合国家立法和地方道德审查小组规定的所有要求。确保所有涉及放射性的实验符合立法和当地规则, 并安全执行。
1. 肿瘤细胞的工程和表征, 以表达放射性核素-荧光融合记者-FP
注意: 为了简单起见, mEGFP A206K 缩写为 "GFP", 在本协议后面的各节中 mCherry 为 "RFP"。
<ol><li>慢病毒载体粒子的产生<ol>
<li>用合适的转染方法生产慢病毒北疆颗粒, 用以下四质粒染293T 细胞: (i) 报告基因编码粒 (pLNT SFFV GFP 或 pLNT SFFV nis-RFP (见补充信息), (二)第三代慢病毒载体包装质粒 pRRE 和 (iii.) pRSV, 和 (iv) 含有粒的病毒包络, e. g, pMD2 g。预混合质粒, 然后再添加到转染组合。在细胞培养罩中进行转染。 注: 补充信息提供其他转染信息。</li>
		<li>通过标准宽场荧光显微术评估48小时后转染成功, 筛选器设置适合所选融合记者 (nis-GFP 或 nis RFP)。 注: 荧光信号表明了报告基因转染, 因此只是一个成功的联合转染的替代品, 而不是一个成功的病毒生产的指标。</li>
		<li>使用注射器, 通过0.45 µm 无菌聚醚砜 (PES) 过滤器过滤, 以去除漂浮细胞和细胞碎片, 以此来获取含有病毒颗粒的上清液。转移到无菌的1.5 毫升聚丙烯反应管。在细胞培养罩中执行病毒工作, 并确保没有活病毒离开所含的环境。</li>
	</ol>
</li>
	<li>癌细胞系表达的转导与选择<ol>
<li>使用从步骤1.1.3 混合 1:1 (v/v) 的纯新鲜病毒与每个癌细胞线的最佳生长培养基 (DMEM 为 MDA-MB-231 细胞和 RPMI 1640 4T1 细胞; 参见材料表为媒介构成)。在细胞培养罩中进行转导。 注: 补充资料中提及更一般的协议。</li>
		<li>在含有 5% (v/v) CO2在37摄氏度 (在 6-井或12井的范围内, 使用1毫升或0.4 毫升的病毒混合物从步骤 1.2.1) 中, 具有含病毒培养基的传感器癌细胞在具有湿润气氛的孵化器中。</li>
		<li>用荧光显微镜监测目标细胞的 FP 表达。</li>
		<li>使用标准的区域性条件将成功的转基因单元格扩展到3-10 个单元格的比例 (请参见 ATCC MDA-MB-231 和4T1 细胞线)。</li>
		<li>使用荧光活化细胞分选 (转基因) 纯化从非细胞中表达细胞的 NIS FP。 注: 可作为支原体感染来源;建议在病毒生产和转导之前检查支原体, 但也应在1.3 步之后再进行。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表达癌细胞系的 FP 的表征<ol>
<li>通过标准流式细胞术确认记者表达式, 如其他28所述。</li>
		<li>按标准免疫印迹法确认报告员的完整性, 如其他地方29 所述。</li>
		<li>用共聚焦荧光显微镜分析细胞内融合报告的定位。 注: 染色或共同表达的等离子膜标记6和随后的联合本地化分析30将促进这一步骤。</li>
		<li>分析放射性在表达细胞系中的吸收。 注: 与现有设备兼容的任何放射性 NIS 基板都是合适的,例如碘化同位素 (123I, 124i-, 125i, 131i-), 99mTcO4-, 188选举事务 4, [18F]3F 或 [18f] BF4。<ol>
<li>种子 106纯化细胞在6井板在他们的最佳的成长介质 (参见材料表) 在实验之前一天。准备所有样品, 并包括控制样品: (i) "特异性控制",即nis 表达细胞预先孵化与竞争性的 NIS 基板, 以测试摄取特异性;(二) "父母细胞控制",即细胞不表达 NIS, 但接受放射性来测试父母细胞的基底吸收。</li>
			<li>第二天早上, 用无血清生长培养基冲洗细胞一次。</li>
			<li>在 50 kBq 99mTcO4或 [ 18F] BF4-的情况下, 在30摄氏度 (37 毫升总容积) 的情况下, 在无血清生长介质中孵化细胞。对于特异性控制, 用竞争性基底次氯酸钠 4 (12.5 µM 最终浓度) 预孵化细胞30分钟.在整个实验中保持竞争的基体浓度恒定。</li>
			<li>收集上清和转移100µL 到一个准备好的收集管标记为 "上清"。</li>
			<li>用含有 Ca2 +/毫克2 +的1毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞两次。收集每个洗涤液, 并将每100µL 到一个被标记为 "wash1" 或 "wash2" 的准备好的收集管中。</li>
			<li>通过添加500µL PBS, 其中包含 0.25% (w/v) 胰蛋白酶和0.53 毫米 EDTA, 并孵化在37摄氏度, 直到细胞分离 (使用显微镜检查可视)。将悬浮液转移到已准备好的收集管上, 标记为 "细胞"。用含有 Ca2 +/毫克2 +的500µL 冷 PBS 冲洗水井, 并将其添加到管 "单元" 中。通过离心 (250 x g, 4 分钟, 4 °c) 来颗粒细胞。</li>
			<li>用正确设置的伽玛计数器为选择的放射性同位素 (这里: 99mTc 或18F), 从每个井中计数所有四个样本类型。 注: 由于本试验中样品数量众多, 建议使用自动衰减校正的全自动γ计数器。</li>
			<li>通过对每个井中样品的伽玛计数进行统计分析, 确定每个井的总放射性计数。 注: 采取 aliquoting 在步骤1.3.4.4 和 1.3.4.5, 以数字乘以10的 "上清" 和 "洗" 分数。</li>
			<li>表达细胞放射性吸收为%Uptake, 如1所示。从三项实验中计算平均值和标准偏差。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57088/57088eq1.jpg">(1) 注: 在这里, 记者验证实验被描述, 但非与记者相关的细胞功能 (例如增殖, 癌细胞入侵, 基因表达等) 最终是特定于应用程序和每个用户的责任。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 建立体内肿瘤模型
<ol><li>仅使用体内实验中的完全特征和经过验证的单元格。每一次都用任何合适的技术 (例如荧光显微镜、流式细胞术) 检查细胞在管理之前的荧光。</li>
	<li>建立5-6 周成年雌性小鼠的肿瘤模型。使用BALB/cAnNCrl或BALB/cAnN. Cg-Foxn1女 (BALB/c 裸) 小鼠为4T1 肿瘤模型和点头。Cg-Prkdc Il2rg tm1WjI/SzJ (核供应核) 小鼠 MDA-MB-231-based 肿瘤模型。在当地剃须动物并使用无菌技术。直接注入50µL 的悬浮液, 其中包含 106 NIS-FP, 表达癌细胞/mL 到乳房脂肪垫之间的第四和第五奶嘴31。 注: 为了提高注射准确度, 建议使用可吸入麻醉剂 (如异氟醚) (O2) 在全麻下进行注射 (1-2% (v/v)。 注: 肿瘤细胞的外科植入是肿瘤模型建立31的一种替代方法。</li>
	<li>检查注射部位的细胞在用药后和早期注射后的荧光。使用荧光火炬和过滤眼镜适合 FP 的选择。</li>
	<li>监测肿瘤的生长并检查任何临床症状 (特别是在以后的时间点)。 注: 对于浅表肿瘤,即本协议中的原位乳腺肿瘤, 使用卡尺和平均肿瘤直径 (MTD) 的公式 = ½·(升 W)32。</li>
</ol>3. 使用自动放射性合成 (ARS) 平台生产 [18 F] BF 4.
注:这里介绍了基于18F 加三氟化硼的方法自动 [18F] BF4合成。更广泛使用的 ARS 平台 (参见材料表) 的用户可以下载在这个平台上运行自动序列所需的相应的可扩展标记语言 (XML) 文件 (补充文件)。图 1中所示的卡带版式的详细说明 (表 1), 以及 XML 序列文件 (表 2) 中每个步骤的详细说明, 以支持翻译到任何其他自动化平台。
<ol><li>按照表 1中的说明设置 ARS 平台, 并确保它使用加载到控制计算机上的正确 XML 文件进行操作。确保 GBq 的平台放置在一个适合安全工作的化学罩中, 放射性物质的含量。</li>
	<li>通过进气藏 (V6), 吸入回旋产生的 [18f] f (通常为2-7 毫升 [ 18o] H2O) 的 1.5-2 GBq。</li>
	<li>在阴离子交换树脂上捕获放射性 (例如季铵盐阴离子交换盒;V5 到 V4), 请在单独的小瓶 (V1) 中恢复 [18o] H2o。</li>
	<li>洗脱 [18 f] f (反向洗脱, V5 到 V4) 进入反应器 (V8), 750 µL 0.9% (w/v) 盐水溶液 (V2), 其次为1.5 毫升乙腈 (V16).</li>
	<li>在真空和氮气流动下, 通过加热在105°c 然后120°c 为5分钟, 去除水。</li>
	<li>将反应堆温度降低到摄氏80摄氏度。</li>
	<li>将800µL 15-冠-5 在无水乙腈 (46 毫克, 0.21 毫摩尔) 到干燥 [18 f] f-通过反应堆的中心端口 (V8).</li>
	<li>添加850µL 的 BF3。氨基酸2在无水乙腈 (0.16 毫克, 1.13 µmol) 到反应器。</li>
	<li>反应5分钟, 同时返回室温。</li>
	<li>将反应混合物通过一个氧化铝墨盒 (V17 到 V18) 来诱捕 trifluoroborate。</li>
	<li>将反应混合物返回注射器 S2, 稀释水 (约1.6 毫升)。</li>
	<li>通过第二阴离子交换墨盒 (V19 到 V20) 将反应混合物传递到陷阱 [18F] BF4产品.</li>
	<li>用水清洗反应堆 (约5.5 毫升)。</li>
	<li>通过氧化铝和第二阴离子交换墨盒的结果解决方案。</li>
	<li>用水冲洗注射器 S2 和 S3。</li>
	<li>用水冲洗第二阴离子交换盒, 用氮气烘干。</li>
	<li>洗脱产品 (V19 到 V20) 与1毫升0.9% 氯化钠 (V14) 入注射器 S3。</li>
	<li>将产品 (400-500 µL) 通过出口线 (V21) 转移到1毫升玻璃收集瓶。 注意: 摩尔活动是每个放射性的一个重要方面。但是, 它的常规确定不仅耗时, 而且需要大量新合成的 [18F] BF4, 这样它就成为了可以成像的动物数量的限制因素.为了测试结果的再现性和摩尔活动 [18F] BF4, 建议为这一目的安排几个专用的测试运行.有关摩尔活动的详细信息, 请参阅讨论部分。</li>
</ol>4. nanoPET/CT 表达细胞的体内成像
<ol><li>动物制剂<ol>
<li>在 1.5-2.0% (v/v) 异氟醚在 O2中的麻醉小鼠, 在感应腔内的流速为 1.0-1.5 升/分钟。检查是否有足够的麻醉寻找没有踏板反射。</li>
		<li>确保在动物眼中应用兽医软膏防止麻醉时的干燥</li>
		<li>将鼠标移动到加热垫上, 并将鼻子放在麻醉电源掩膜中, 然后将尾部加热 (例如, 将其浸入37°c 水中或使用红外线灯)。</li>
		<li>稀释新鲜制备的无菌过滤 [18F] BF4-解决方案到 5 MBq 每50µL 与0.9% 无菌生理盐水。</li>
		<li>使用与皮下注射针连接的注射器 (标尺 29-31), 绘制100µL [18F] BF4解决方案, 测量注射器中的放射性, 并记下测量的值和时间.</li>
		<li>静脉注射管理50µL 的 [18F] BF4-解决方案进入预热后的尾部静脉。</li>
		<li>测量注射器中剩余的放射性, 并记下测量的值和时间。在步骤4.1.7 和4.1.5 测量值之间的差异是注入剂量 (ID)。</li>
		<li>设置一个定时器从45分钟倒计时 (PET 成像的开始时间 = 0 分钟)。</li>
		<li>将鼠标放到 nanoPET/CT 扫描仪的床上, 确保麻醉药的供应正确地重新连接。</li>
		<li>检查麻醉仍然完整的测试没有踏板反射。</li>
		<li>确保鼠标按所需的方式放置在床上,例如"狮身人面像" 的位置。</li>
		<li>根据制造商的建议安装动物监测设备,例如直肠温度探头、测量动物呼吸的探针或用于记录心电图的电极。检查所有仪器的正常功能。 注意: 在与 NIS 放射性 [18F] BF4-的活体特异性测试中, 动物的图像如上所述, 然后休息, 直到放射性已经腐烂足以被视为微不足道,例如。48 h 以后, 当仅 1.3·10−6 % 剩余18F 放射性将存在于动物。在随后的成像会话中, 具有竞争性的基板4在放射性管理之前以200毫克/千克30分钟的剂量进行管理, 并按上述方式执行成像.</li>
	</ol>
</li>
	<li>nanoPET/CT 成像<ol>
<li>设置所需的 CT 成像参数,例如使用 nanoPET/CT 55 kVp 管电压, 将曝光时间设置为1200毫秒, 带有一度角步进和180度投影。</li>
		<li>设置 PET 图像采集的参数。使用静态扫描 PET 参数的持续时间为30分钟, 1:5 重合模式和 400-600 keVp 能量窗口。</li>
		<li>倒计时时间 = 15 分钟开始 CT 图像采集。</li>
		<li>倒计时时间 = 0 分钟开始 PET 图像采集。<ol>
<li>如果需要序列动物影像, 让动物完全从麻醉中恢复,即在监督下恢复知觉。随后, 将其转移到维修单位。</li>
			<li>如果这是终端成像会话, 则通过麻醉过量、二氧化碳浓度升高或颈部脱位来进行动物安乐死。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.体内数据分析
<ol><li>用蒙特卡罗的全3D 迭代算法重建 PET/CT 数据。确保对衰减、死时和放射性同位素衰变的校正进行考虑。有关详细信息, 请参阅制造商在使用的 PET/CT 仪器的说明。</li>
	<li>检查 CT 和 PET 图像是否正确地联合注册, 并保存数据的适当的交换格式, 如 ' 数字成像和通信在医学 ' (DICOM)。</li>
	<li>分析图像<ol>
<li>将重建的 DICOM 文件加载到合适的图像分析软件中, 以使这些 ROIs 中的感兴趣区域 (ROIs) 和随后的 PET 信号量化得到识别和划分。</li>
		<li>使用手动或自适应阈值对 ROIs 进行分段, 以使用适当的软件包定义 ROIs33、34 。CT 扫描的解剖图像信息有助于指导 ROI 分配,例如表面肿瘤或肺体积。</li>
		<li>根据制造商的指示使用分析软件, 并确保数据被校准到注入的放射性剂量, 并纠正衰减和放射性衰变。</li>
	</ol>
</li>
	<li>绘制显示此体内量化数据的图表。表达数据为注射剂量/容积 (%ID/毫升) 或标准摄取值 (SUV), 这是考虑到整个主体的放射性的替代措施。<ol>
<li>计算%ID/g 值, 假设组织密度像水, 即1克/升。值得注意的是, 这种假设可能是无效的器官具有明显不同的密度, 如肺或骨骼。</li>
		<li>计算不同的 suv 估计真正的 suv (e. g。SUVmean, SUVmax);SUVmax 对小对象更可靠, 并且比 SUVmean35更常用。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6.前体分析
执行所列下游分析: (一) 在动物解剖过程中含有荧光癌细胞 (原发肿瘤和转移) 的器官的荧光成像, (ii) 放射性组织分布的测量, (iii) 组织学或 (iv.)细胞癌症器官的评估。
<ol><li>用γ计数 (体外体内) 和体外荧光成像方法测量癌组织的放射性分布. <ol>
<li>测量整个死亡动物的放射性, 并记下其价值和时间。</li>
		<li>解剖动物和收获以下组织: 肺, 心脏, 血液 (使用20毫米玻璃毛细血管), 肝脏, 胃, 肾脏, 脾脏, 小和大肠, 甲状腺和涎腺, 一条肌肉从腿, 和骨头的后方股骨, 和相关和 dissectible 淋巴结和癌组织。</li>
		<li>先测量剩余胴体的放射性, 包括尾部, 并记下测量的值和时间。 注意: 尾部的放射性可以被认为是放射性的, 因为它是错误注射的, 因此没有达到循环;因此, 这一量的放射性是没有贡献的注射剂量。尾部放射性也作为注射质量的追溯参数。</li>
		<li>权衡所有组织 (使用预重管)。</li>
		<li>在日光下和荧光光下拍摄癌变器官的照片。 注: 使用相机支架保持相机镜头和器官常量之间的距离 (或为此目的使用专用的商用仪器)。</li>
		<li>将用于下游组织学的器官/组织嵌入 OCT 或将其浸入福尔马林中以进行固定。为其他下游应用样品准备可能不同。</li>
		<li>准备放射性校准标准的副本,例如0 到 1000 kBq [18F] BF4-。 注: 校准标准要求 (i) 将测量的计数每分钟与放射性值 (kBq) 相关联, (二) 简化衰变校正;18F-可以替换 [18F] BF4-。</li>
		<li>使用γ计数器和步骤6.1.7 中的放射性校准标准来计算所有收获组织的放射性。注意测量的时间。如果计数率太高 (即在校准标准的线性度之外或由太高的探测器死时间指示), 重新计数样品二放射性半衰期以后。</li>
		<li>目前的数据, 无论是%ID/g 或标准摄取值 (SUV) (2)。 SUV = (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57088/57088eq2.jpg"></li>
		<li>根据当地废物管理规则, 丢弃不需要进行进一步下游分析的所有收获组织。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根据用户的喜好和标准协议 (如其他3,6,28), 通过细胞术或组织学分析癌症组织。</li>
</ol>

作者声明他们没有竞争的财政利益。

通过此方法使癌细胞可溯源到体内的第一步需要工程它们来表达 NIS-FP 融合报告。在融合报告中, 荧光蛋白的选择是至关重要的, 因为 oligomerizing 荧光蛋白可以导致人工的报告聚类, 从而对其功能产生负面影响。我们已经成功与证明单体荧光蛋白, 如 mEGFP (monomerizing 突变 A206K36,37), mTagRFP, 或 mCherry。NIS 可以是人或老鼠起源 (hNIS 或 msNIS) 取决于实验的目的和癌症模型。转导效率通常在不同的癌细胞系之间变化。然而, 在本议定书中, 产生的癌细胞系随后被净化, 从而减少了优化转导条件的需要。转导与高多样性的感染并不总是可取的, 因为多重结构整合到基因组可能会导致不仅在更高的构造表达, 而且在更不需要/不受管制的基因组修改。因此, 让多克隆转基因细胞生长到表达的稳定性是很重要的 (流式细胞仪监测), 并避免仅通过观察者对最明亮的克隆进行排序。它还使非报告功能的功能验证在这些单元格应用于体内实验之前至关重要。最近开发的替代病毒基因传递是基因编辑技术38, 它提供了更具体的控制病毒整合网站。流式细胞术和免疫印迹法表达分析是很重要的。流式细胞术允许获取基于人口的单细胞数据, 例如, 检查是否有任何漂移在记者的表达水平随着时间的推移。它只依赖 FP 基团, 除非细胞也沾有针对表面或全 NIS 的抗体。流式细胞术不通知融合记者的完整性。相比之下, 免疫印迹法报道了融合记者的完整性。必须增加 nis 和 fp 的分子量, 以确定所选择的 nis fp 的预期分子量. 共焦荧光显微术显示融合记者定位与等离子膜标记小麦胚芽凝集素在所有新的做了细胞系。这是大多数蛋白质的预期细胞位置, 并指出了后续功能验证的前进里程碑。如果在等离子膜上发现了最小/no NIS (例如仅在内部蜂窝隔间), 这将表明与该细胞系中的融合记者的细胞生物学问题, 或融合记者潜在的突变影响其细胞内贩运。值得注意的是, 我们没有观察到迄今为止我们测试过的任何癌细胞中的这种情况, 其中包括: A375P、A375M2、SK-Mel28、WM983A/B (人黑色素瘤);MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (人乳癌);NCI-H1975 (人肺癌);SK-Hep1 (人肝癌);4T1, 4T1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (小鼠炎症性乳腺癌);B16F0, B16F3, B16F10 (小鼠黑色素瘤);MTLn3 (大鼠乳腺腺癌)。
nis 函数必须使用具有放射性 NIS 基底的吸收检测来测量。由于显式放射性99mTcO4是生成器, 因此在医院中广泛提供, 而无需任何放射性合成, 并且具有更方便的更长半衰期 ( 99m的6.01 小时Tc 与18F 相比为110分钟), 我们使用此 NIS 基板对新的 nis FP 表示单元格行进行常规功能验证。用 nis co 基片对 nis 表达细胞进行预阻塞, 导致放射性吸收的预期减少/废除, 从而表明放射性吸收的特异性。此 NIS 专用性测试是关键的验证步骤。如果 nis 特异性实验不会导致放射性摄取量与各自的父母细胞相媲美, 则在实验过程中出现技术错误, 或者放射性摄取不是由 nis 引起的。此外, 高氯酸钠预堵塞也可能减少父母细胞系中的放射性吸收;这将识别具有内源功能 NIS 表达式的单元格线 (例如刺激的甲状腺细胞6)。
此映像协议的一个关键优点是, 信息是在3D 和一段时间内收集的。这允许比较同一动物的图像, 随着时间的推移, 从而提供配对的数据, 从而克服了动物间的变异引起的问题。这与大多数非成像相关的转移评估方法相比, 是基于在不同时间点牺牲不同的动物。在图 3B中, 显而易见的是, 随着时间的推移, 转移性传播和生长产物在单个动物中的进展情况。PET/CT 图像检测的信号从根本上是由 NIS 表达引起的。这包括所有的信号从外部 nis 表达癌细胞和所有器官内在表达 nis。典型的内源性 NIS 信号在甲状腺和涎腺, 胃, 以及在乳腺和泪腺体的某些部位的低水平中发现。除了内源 NIS 表达式之外, nis 放射性 [18F] BF4也通过肾脏排泄, 从而解释了尿液填充膀胱中的放射性摄取量.在本协议建议的成像时间点 (45 分钟后放射性注射6) 中, 肾脏吸收不再被检测到。如果来自尿液膀胱的信号会导致信号到背景的问题, 膀胱可以在麻醉前机械地排空, 然后再进行成像。重要的是, 内源信号可以不同的动物菌株。另外值得注意的是, 在泌乳条件下, 乳腺内源性 NIS 的表达可能会更高10。在所提出的情况下, 在这些转移细胞线的情况下成功地描绘之前 (cf列表), 我们没有发现内源 NIS 表达, 以显著干扰转移检测。值得注意的是, [18F] BF4-与碘化物相比, 仍然可以更有效地吸收到癌变组织中, 因为碘化物代谢成甲状腺激素6。与 [18F] BF4-6相比, 这种现象也可能导致血流中 radioiodide 的数量增加。对于不同的应用 (癌症细胞追踪在其他癌症或非肿瘤细胞追踪应用), 这可能会有所不同, 因此建议评估内源 NIS 表达式是否可能导致信号到背景的问题, 通过初步实验。临床前成像的一个重要方面是放射性的摩尔活动。此处描述的方法使用 1.5 GBq 18F 作为起始材料 14 , 并已显示出在先前报告的替换方法12上产生的摩尔活动显著高于此。[18F]BF4-在摩尔活动中产生≤1 GBq/µmol12可导致对 NIS 表达组织的吸收减少。这是特别重要的, 当注入量的放射性每公斤高,即当小动物如小鼠被成像39;它在人工设置40中不那么重要。因此, 高摩尔的活动是至关重要的高质量的前临床 PET 成像。三氟化硼添加方法所获得的摩尔活性14在本协议的自动表单中显示, 克服了此问题。此外, 值得注意的是, 为 [18F] BF4合成而提出的协议不符合良好的生产实践 (GMP), 因此不适用于这种形式的人体临床试验.GMP协议 (通过18F 替换方法到 radiolabel BF4) 在别处可利用40。
PET/CT 成像允许可视化的放射性摄取, 这表明了 nis 介导的放射性的吸收, 源于 nis 表达癌细胞。更重要的是, 相关的 PET 信号可以量化。有必要采用可靠的阈值程序, 以确保从任何潜在背景中对相关信号进行一致和无偏见的区分。由于背景变化在不同的位置在体内, 重要的是考虑局部/区域的阈值和分割。一个这样的方法是通过和命名的, 在大津34之后开发的, 它的3D 实现被用于3D 呈现本协议中的原发肿瘤和转移。通常情况下, 观察者所看到的图像相对于量化的%injected 剂量 (%ID) 值是最好的。至于基于图像的量化, 也重要的是标准化的测量放射性值的不同组织的体积。有两种主要使用的方法表示规范化的结果, (i)%ID 每卷 (例如%ID/mL), 和 (ii) 标准摄取值 (SUV35)。它们的不同之处在于,%ID/mL 仅考虑到单个体积, 而 SUV 则是相对于整个动物的平均放射性的量度。还必须注意的是, NIS 映像呈现活体肿瘤容积 (按揭), 因为未合成 ATP 的死/死细胞不能再导入放射性10。这解释了大的低信号区域在主要肿瘤 ("圆环形" 肿瘤) 表明区域肿瘤细胞死亡或坏死。重要的是, 与测径仪测量的粗肿瘤体积相比, 按揭是一种更可靠的肿瘤负担测量方法 (不考虑生存能力和仅评估表面肿瘤区域)。
这种双模式跟踪策略的一个主要优势是明显的, 当收获组织后, 动物剔除。以体内图像为指导, 在动物解剖过程中由荧光癌细胞辅助, 也可以可靠地收获小而深的器官/转移物。冷冻组织保存/切片方法可以直接荧光成像的 gfp 不需要染色的抗 GFP 抗体, 但以减少结构组织保存比福尔马林固定石蜡嵌入方法学 (FFPE)。后者批判地也需要抗 FP 染色, 因为 FFPE 方法是不相容的荧光蛋白的完整保存 (由于固定/脱水/补液)。虽然荧光信号表明肿瘤细胞存在, 但重要的是要确保这种分类被证实的体外放射性测量的收获组织 (' 体内 '). 前体放射性测量比目视荧光检测更敏感, 因此可以识别癌细胞依赖的信号, 否则将无法被发现。在终端成像会话的情况下, 重要的是要准确地注意到注射放射性量以及放射性放射性测量的次数, 动物注射, 动物剔除, 和校准闪烁计数器测量收获的组织。这是至关重要的, 以确保纠正放射性衰变, 从而使可靠的体内分析。
PET/CT 成像能够重复非侵入性的3D 定量肿瘤进展, 包括评估转移扩散的全身水平。这一特征比传统方法有显著的优势, 通常依赖于大规模的动物群, 在不同的时间点对肿瘤进展进行评估。这种基于图像的方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D体内量化, (ii) 由于重复成像的可能性, 动物数量显著减少 (iii) 获得纵向配对数据从随后的影像学会话中, 通过排除动物间的变异来改善统计数据, 这反过来又进一步减少动物数量, (iv) 在高特定活动时自动生产 [18F] BF4- (v)在组织中通过荧光方法 (如显微镜或细胞术) 确认的前体的内在选择。
体内单元格跟踪是一个不断增长的字段。近年来, 成像技术取得了新的进展, 从而提高了分辨率、检测极限和多重能力 (通过多模态成像)。在本议定书中, 我们应用这个概念来跟踪肿瘤进展, 包括自发性癌细胞转移在3D 通过重复成像。应用包括旨在解开自发性癌细胞转移机制的研究。例如, 可追踪的肿瘤细胞可以用来研究不同免疫细胞成分 (在不同 immunocompromisation 水平的动物菌株中的目前/功能) 对转移过程的影响。同样, 可以研究单个基因在动物菌株或癌细胞系中的影响。此外, 所提出的议定书可用于评估/验证特定药物或治疗概念对肿瘤进展的有效性。重要的是, 这个记者基因: 放射性对 PET 成像 (NIS: [18F] BF4-) 也可以用于不同的单元跟踪应用程序。例如, 一些细胞疗法目前正在成为有希望的治疗方法。这包括癌症治疗的细胞疗法41 , 但也在移植42和再生医学43,44设置。全身性的体内细胞追踪对细胞疗法的发展和临床翻译变得越来越重要, 例如, 评估安全性和治疗监测。

转移性疾病是导致大多数癌症相关死亡的原因1。尽管对转移过程进行了广泛的研究, 但对动物模型系统中肿瘤转移的可靠监测很难实现。在全身成像技术和多模态成像方法方面的最新进展使非侵入性的体内细胞跟踪2,3,4,5。后者可作为一种工具, 监测细胞的存在、分布、数量和生存能力, 非侵入性和反复在活的动物或人类。
这里描述的方法的目的是在3D 的活体啮齿动物肿瘤模型中纵向和非侵入性的跟踪癌细胞。使用这种方法, 研究人员将能够准确量化肿瘤进展, 包括转移扩散在3D。与传统的非成像技术相比, 该方法提供了大量减少动物数量的定量数据的获取。此方法的另一项功能是, 它允许通过组织学或细胞术3、6, 将体内成像与经过简化的下游前体分析所收获组织中的跟踪细胞进行关联。
这一方法的发展的基本原理是提供一个体内工具, 以监测和量化的整个转移过程的啮齿动物肿瘤模型。重要的是, 它的目的是尽量减少动物的使用, 同时减少动物间的变异。纵向无创全身成像是非常适合告知转移性生长, 而本身很难准确预测其发生的时间和地点. 因此, 全身3D 成像一直是方法开发的中心。为了缩小全身体内成像和潜在的下游前体组织学确认之间的比例差距, 采用了基于双模式核素荧光报告器的多尺度成像方法3, 6。
正电子发射层析成像 (PET) 是目前可用的最敏感的3D 全体成像技术, 提供卓越的深度穿透和绝对量化7 , 分辨率为 < 1 毫米8,9。目前, 放射性核素成像对全身水平的临床前细胞追踪可以可靠地检测到每卷100万个细胞的密度为1000个细胞的细胞(3,6 ), 并在亚毫米区域有分辨率。与活体显微术不同, 它不能检测单个癌细胞的传播, 但不需要手术程序 (例如, 如窗口室), 不限于小范围的视野, 而不是通过低组织穿透和分散。生物发光成像提供了一种廉价的替代方法, 但与散射和光吸收问题以及深度渗透率差有关, 因此在量化2中受到严重限制。荧光全身成像已被用于获取3D 图像, 但它比生物发光或放射性核素技术2更敏感。尽管如此, 荧光提供了通过细胞术或显微镜进行前体下游组织分析的机会。后者关闭了宏观全身成像 (mm 分辨率) 和荧光显微组织分析 (µm 分辨率) 之间的尺度间隙3。因此, 放射性核素和荧光模式相辅相成, 从全身水平到 (分) 细胞尺度不等。
在转移研究中, 报告基因成像非常适合于延长细胞追踪的需要。在这个应用中, 它优于直接细胞标记, 因为它是 (i) 不受标签稀释的影响, 从而不限制在跟踪时间, (ii) 更好地反映活细胞数。因此, 全身细胞跟踪对于可追踪细胞增殖或扩展体内(例如癌症研究36) 的应用程序特别有用, 用于检测茎部畸胎瘤的形成。细胞研究, 或免疫细胞膨胀的量化5。
各种放射性核素为基础的报告基因可用2。这些酶包括单纯疱疹病毒 HSV11 胸苷激酶 (HSV1-tk), 转运体, 如碘化钠转运体 (NIS) 或去甲肾上腺素转运体 (NET), 以及细胞表面受体, 如多巴胺 D2 受体 (D2R)。NIS 是一种糖化的跨膜蛋白, 主动调节碘吸收, 例如在甲状腺卵泡细胞为随后合成甲状腺激素10。此过程由 na+的 symport 驱动, 依赖于由 na+/K+-atp 酶11维护的细胞钠梯度。因此, 由于碘/放射性摄取链接到活动 Na+/K+渐变而不是仅仅存在传输器, NIS 比其他记者更好地反映活细胞数。传统上, radioiodide 已用于 NIS 映像。对于细胞追踪, 未被报道在甲状腺内代谢的替代 NIS radiotracers 被报告为高级6。最近开发的 PET 放射性 [18f] 四氟硼酸 ([18f] BF4-)12,13显示优于 radioiodide6的药代动力学, 同时被可在高特定活动14中使用, 而不需要复杂的放射化学设施。[18F]BF4可以通过两种不同的方法进行合成.第一种方法是基于在 BF4与放射性18F12的非放射性的19F 的同位素交换。第二种方法是将18F 添加到非放射性的三氟化硼14中。报告后一种方法可产生更高的特定活动14 , 是临床前成像的首选方法。
NIS 在甲状腺组织中有很高的表达。它也表达在唾液, 泪和泌乳乳腺以及胃, 但在较低的水平相比, 甲状腺10。因此, 可以使用 NIS 来实现其他体区域的优异对比度成像。它也高度同源的人, 鼠和鼠标10。此外, 在非甲状腺细胞中没有对异位 NIS 表达的毒性报告。重要的是, NIS 也没有与宿主免疫应答相关, 无论是人类还是啮齿动物。NIS 已被用作测试启动器活动的报告基因15,16,17和基因表达式18,19,20,21,22 ,23在几个不同的上下文中。它也被用于基因治疗载体的非侵入性成像24,25, 并跟踪心脏4, 造血26, 炎症5和神经研究27的细胞。最近, NIS 也被用作跟踪肿瘤转移的报告基因在体内3,6。
总之, 此方法优于以前的技术的主要优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D在体内定位和量化转移扩散, (二) 自动化生产 [18F] BF4- at高摩尔活动, (iii) 通过纵向成像大幅度减少所需的动物, (四) 从随后的成像会议获得配对的数据, 从而改进统计数据, 进而进一步减少动物的使用, (v)通过细胞术或荧光显微镜在组织中确认癌细胞的内在选择.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Step 1) Engineering and characterization&amp;nbsp; of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&#039;-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5&#039;-Bi-1H-benzimidazole</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.</td></tr><tr><td>4T1 murine breast cancer cell line</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>for details see ATCC website</td></tr><tr><td>Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Model TT Cell Counter and Analyzer</td></tr><tr><td>CASYclean Cleaning Reagent</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>CASYton Isotonic Diluent</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Fluorescence Microscope, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>Equipped with Plan-Neofluor 25&amp;times;0.5NA and Plan-Apochromat 63&amp;times;1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis</td></tr><tr><td>Cover slips No. 1.5 thickness</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Supplement with 10 % (v/v) FBS and &lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.</td></tr><tr><td>FACS sorter, e.g. BD FACSAria III&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 &amp;mu;m nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 &amp;mu;m, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Heat inactivated at 56 &amp;deg;C for 30 min</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc-pertechnetate energy window 110-155 keV&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 18F energy window 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &amp;micro;g/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Linear polyethylenimine (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 human breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>for details see ATCC website</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>request from our lab</td><td>n/a</td><td>For details (generation and maps) see Supplementary Information</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>request from our lab</td><td>n/a</td><td>For details (generation and maps) see Supplementary Information</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>plasmids encoding for the VSV-G envelope</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>packaging plasmid</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>packaging plasmid</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>From &lt;em&gt;Streptomyces alboniger&lt;/em&gt;, reconstituted in sterile water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Supplement with 10% (v/v) FBS and &lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.</td></tr><tr><td>SFCA Syringe filter 0.45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes 10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Disposable non-sterile syringes</td></tr><tr><td>Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Cell Imaging System equipped with a 10&amp;times; objective (PlanFL PH2, 10&amp;times;/0.25, &amp;infin;/1.2) and a colour camera</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution 10X&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td>(0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>W21404</td><td>Used at 1:1000 (2 &amp;micro;g/mL) for cell immunofluorescence</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 2) Establishment of &lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; tumor models.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital caliper</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>For inhalation</td></tr><tr><td>Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)</td></tr><tr><td>Syringes 0.3 mL U-100 insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &amp;times; 1/2&#039;&#039; - 0.33 &amp;times; 12 mm</td></tr><tr><td>Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 3) Production of [&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F]BF&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; using an automated radiotracer synthesis platform.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitrile (anhydrous)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Boron trifluoride diethyl etherate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;.OEt&lt;sub&gt;2,&lt;/sub&gt; purified by redistillation, &amp;ge;46.5 % BF&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; basis. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Developer pack</td></tr><tr><td>Polygram Alox N/UV254 polyester sheets</td><td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC plates, 40&amp;times;80 mm</td></tr><tr><td>Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)</td></tr><tr><td>Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light</td><td>Waters</td><td>WAT023561</td><td>Condition with H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)</td></tr><tr><td>Water for injection USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen filter</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Sterile 0.2 &amp;micro;m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Step 4) &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>For inhalation</td></tr><tr><td>Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)</td></tr><tr><td>Rodent anesthesia induction chamber</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)</td></tr><tr><td>Rodent anesthesia system</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer</td></tr><tr><td>Sterile physiological saline</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>Syringes 0.3 mL U-100 insulin</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G &amp;times; 1/2&#039;&#039; - 0.33 &amp;times; 12 mm, for intravenous injection of radiotracer</td></tr><tr><td>Veterinary Scavenger</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5) &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; data analysis.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6) &lt;em&gt;Ex vivo&lt;/em&gt; analyses&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D</td><td>Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 22&amp;times;50 mm</td><td>VWR International</td><td>SMITMCQ211022X50</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat, e.g. Cryostat MNT</td><td>SLEE Medical</td><td></td><td>two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson/Stratech</td><td>111-175-144</td><td>Used at 1:500 (2 &amp;micro;g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/mL</td></tr><tr><td>Microtome blades, e.g. Feather S35&amp;nbsp;</td><td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Equipped with 10&amp;times;, 20&amp;times; (air) and ideally 40&amp;times; (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5</td></tr><tr><td>Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Equipped with GFP and RFP emission filters</td></tr><tr><td>O.C.T. compound&amp;nbsp;</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Wax pen, e.g. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 &amp;micro;g/mL) for tissues immunofluorescence</td></tr><tr><td>Microscope slides, e.g. Superfrost slides</td><td>VWR, Lutterworth, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)</td><td>available from various suppliers.</td><td></td><td>Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4</td></tr></tbody></table>

radionuclide-fluorescence reporter gene imaging to track tumor progression in rodent tumor models

转移是导致大多数癌症死亡的罪魁祸首。尽管进行了广泛的研究, 机械上对转移控制的复杂过程的理解仍然不完整。体内模型对于转移研究至关重要, 但需要细化。通过非侵入性的体内成像跟踪自发转移现在是可能的, 但仍然具有挑战性, 因为它需要长时间观察和高灵敏度。我们描述了一个纵向联合放射性核素和荧光全身在体内成像方法跟踪肿瘤进展和自发转移。这个记者基因方法论使用碘化钠转运体 (NIS) 融合到荧光蛋白 (FP)。肿瘤细胞的设计, 以稳定的表达 NIS, 然后选择基于荧光活化细胞排序。在小鼠中建立了相应的肿瘤模型。使用 nis 放射性 [18F] BF4-, 通过正电子发射层析成像 (PET) 在全身水平追踪表达癌细胞的非侵入式的体内。PET 是目前最敏感的体内成像技术, 可在此范围内使用, 并实现可靠和绝对量化。目前的方法要么依靠大规模的动物群, 为转移评估在不同的时间点, 或依赖于几乎可量化的2D 成像。所述方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性体内3D pet 成像和量化, (二) 自动 pet 示踪剂生产, (iii) 由于重复成像选择, 大量减少所需的动物数量 (iv)从随后的成像会话中获取配对的数据, 提供更好的统计数据, (v) 通过荧光显微镜或细胞仪对组织中的癌细胞进行前体确认的内在选择。在本协议中, 我们描述了常规 NIS FP 提供的非侵入性体内癌细胞跟踪所需的所有步骤, 使用 PET/CT 和前体确认体内结果。当在体内定位、扩展和对细胞群进行长期监测时, 该协议的应用超出了癌症研究的范围。

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Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

我们描述了一个协议, 为临床前在体内跟踪肿瘤转移。它的基础上的放射性核素荧光记者结合碘化钠转运体, 检测到非侵入性 [18 F] 氟硼酸盐-PET, 和荧光蛋白, 简化了前体确认. 该方法适用于肿瘤生物学以外的临床前体内细胞追踪。

核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

radionuclide-fluorescence-reporter-gene-imaging-to-track-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.9K 次观看.  King's College London. 我们描述了一个协议, 为临床前在体内跟踪肿瘤转移。它的基础上的放射性核素荧光记者结合碘化钠转运体, 检测到非侵入性 [18 F] 氟硼酸盐-PET, 和荧光蛋白, 简化了前体确认. 该方法适用于肿瘤生物学以外的临床前体内细胞追踪。

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Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will survive longer than five years. In order to understand and mimic the microenvironment of pancreatic tumors, we utilized a murine orthotopic model of pancreatic cancer that allows non-invasive imaging of tumor progression in real time. Pancreatic cancer cells expressing green fluorescent protein (PANC-1 GFP) were suspended in basement membrane matrix, high concentration, (e.g., Matrigel HC) with serum-free media and then injected into the tail of the pancreas via laparotomy. The cell suspension in the high concentration basement membrane matrix becomes a gel-like substance once it reaches room temperature; therefore, it gels when it comes in contact with the pancreas, creating a seal at the injection site and preventing any cell leakage. Tumor growth and metastasis to other organs are monitored in live animals by using fluorescence. It is critical to use the appropriate filters for excitation and emission of GFP. The steps for the orthotopic implantation are detailed in this article so researchers can easily replicate the procedure in nude mice. The main steps of this protocol are preparation of the cell suspension, surgical implantation, and whole body fluorescent in vivo imaging. This orthotopic model is designed to investigate the efficacy of novel therapeutics on primary and metastatic tumors.

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

胰腺癌的荧光原位小鼠模型

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

科研

癌症研究

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.

Diffuse fluorescence tomography offers a relatively low-cost and potentially high-throughout approach to preclinical in vivo tumor imaging. The methodology of optical data collection, calibration, and image reconstruction is presented for a computed tomography-guided non-contact time-domain system using fluorescent targeting of the tumor biomarker epidermal growth factor receptor in a mouse glioma model.

电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物的肿瘤生物标志物的本土化

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

医学

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>体内成像测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

体内研究 影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

小鼠模型的非侵入性成像检测和监测卵巢癌复发

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

肿瘤进展和血管生成的双生物发光成像

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

In Vivo Fluorescence Imaging to Localize Antibodies in a Mouse Tumor Xenograft Model

Source: Shivange, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
The video demonstrates a fluorescence imaging method for in vivo antibody localization in a mouse tumor xenograft model. It involves the injection of tumor cells in a mouse to generate solid xenografts beneath the skin. Subsequent injection of fluorescent antibodies confirms specific localization through enhanced fluorescence signals within the tumor xenograft.

体内荧光成像定位小鼠肿瘤异种移植模型中的抗体

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Antibody-Based Imaging and Detection Methods

An In Vivo PET Imaging Technique to Detect Tumors in a Murine Model Using Radiolabeled Antibodies

Source: Zeglis, B. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52521">The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique involving a radioimmunoconjugate for the in vivo imaging of a tumor in a mouse model. Upon injection of the radioimmunoconjugate, the antibodies of the conjugate bind to a specific membrane antigen on the cancer cells. The radiotracer of the conjugate emits positrons that interact with neighboring electrons to produce energy, which is detected by a positron emission tomography (PET) scanner to create an image of the tumor.

一种使用放射性标记抗体检测小鼠模型中肿瘤的体内 PET 成像技术

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. In ...

核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

摘要

探索更多视频

此视频中的章节

胰腺癌的荧光原位小鼠模型

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究

电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物的肿瘤生物标志物的本土化

体内研究影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

体内研究影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

小鼠模型的非侵入性成像检测和监测卵巢癌复发

肿瘤进展和血管生成的双生物发光成像

体内荧光成像定位小鼠肿瘤异种移植模型中的抗体

一种使用放射性标记抗体检测小鼠模型中肿瘤的体内 PET 成像技术

核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

摘要

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此视频中的章节

胰腺癌的荧光原位小鼠模型

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

胶质瘤移植中体内成像的荧光分子层析成像研究

电脑断层导引的时域漫荧光体层摄影术在小动物的肿瘤生物标志物的本土化

体内研究 影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

体内研究 影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

小鼠模型的非侵入性成像检测和监测卵巢癌复发

肿瘤进展和血管生成的双生物发光成像

体内荧光成像定位小鼠肿瘤异种移植模型中的抗体

一种使用放射性标记抗体检测小鼠模型中肿瘤的体内 PET 成像技术

体内研究影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

体内研究影像学检查测量原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移