肿瘤进展和血管生成的双生物发光成像

血管生成在肿瘤转移和进展中起着重要作用。在该协议中，我们将使用双生物发光成像方法监测乳腺癌小鼠模型中的动态肿瘤进展和血管生成。在此模型中，我们可以分别通过萤火虫荧光酶和雷尼拉荧光酶成像，在单个小鼠中同时跟踪肿瘤生长和血管发生。

该模型可广泛应用于抗肿瘤药物筛选和肿瘤学研究。这种双生物发光模型可用于跟踪肿瘤进展和回归，并检测肿瘤相关的分子过程，以响应治疗策略。血管生成是肿瘤进展的一个关键过程。

因此，以视觉和敏感的方式监测肿瘤进展和血管生成对于开发有效的肿瘤治疗是必要的。我们实验室的学生张凯月、王晨和尚晨将演示这些程序。对于扁病毒包装和生产种子1倍10至6的293T细胞在两毫升DMEM，辅以10%胎儿牛血清每井到六井板过夜培养在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养。

第二天早上，将7.5微升脂体与250微升的最小基本介质混合在两个独立的1.5毫升管中，在室温下孵育5分钟。为了准备DNA解决方案，将质粒扁病毒RR载体和帮助质粒添加到250微升的最小基本介质在个别1.5毫升管，如表中概述。在孵化结束时，以滴滴的方式轻轻地将DNARR溶液加入脂质体悬浮液中，并允许DNA在室温下与脂质膜结合20分钟。

当混合物孵育时，用一毫升新鲜培养培养物替换293T细胞培养物的上一提液，并轻轻地将0.5毫升的适当脂体DNA混合物添加到每一个井中。将细胞返回细胞培养箱12至16小时，然后用一毫升新鲜培养培养剂补充抗生素，更换每井中的上能。再孵育36小时后，将中继细胞集中到每扁病毒株的锥形管中，通过离心沉淀293T细胞。

然后将含有扁病毒RR的超级纳酸转移到单个1.5毫升无菌聚丙烯储存管中，在零下80摄氏度下储存。对于4T1乳腺肿瘤细胞中基因表达的延脱病毒转导，用一毫升新鲜RPMI基细胞培养基，辅以胎儿牛血清和一毫升的扁病毒蛋白，取代六井4T1细胞培养板每个井中的上能。然后在每毫升多聚苯丙胺中加入8微克，轻轻移液几次混合。

离心板，以帮助提高转导效率，并返回细胞培养箱4至12小时。在孵育结束时，用补充血清和抗生素的新鲜培养基替换每井中的上经剂，以去除任何扁病毒颗粒和多聚布雷恩。要选择扁病毒转导细胞，以一到三比一比四的转导4T1细胞培养，用选择培养基，每两到三天改变一次培养基。

经过七天的选择培养，在荧光倒置相对比显微镜下查看转导细胞培养，并计算红色荧光蛋白阳性或RFP-4T1细胞的数量以及三个视觉领域的所有4T1细胞，以估计RFP阳性比。要建立带肿瘤的小鼠模型，在每60毫米培养板用两毫升胰腺素-EDTA分离细胞之前，用PBS清洗80%的汇合传感器细胞培养物。当细胞从板底提升时，每盘用5至10毫升血清补充介质停止反应。

并转移培养物到单独的15毫升离心管计数。将细胞稀释至每100微升培养基的10至6个细胞，无血清浓度。皮下将100微升的4T1-RR细胞系注射到麻醉肿瘤模型小鼠的左肩，将4T1-RRT细胞系的100微升注入同一小鼠的右肩。

注射后，将每只小鼠放在适当的恢复区域，并配备热支撑，直到完全恢复。每天对肿瘤质量进行7天的治疗，以确认小鼠具有肿瘤。在植入后的第七天，在实验结束之前，每天向每只含肿瘤小鼠注射50微克，每公斤甘西洛维。

对于肿瘤生长，打开活成像系统。初始化活成像软件并初始化系统。当系统初始化时，使用胰岛素注射器将每只小鼠注射到回溯杆中，用适当体积的 coelenterazine 进行成像。

将注射小鼠放入相机室，并立即获取小鼠多张照片，以便从 4T1 细胞获取雷尼拉荧光酶信号，直到生物发光信号消失。在雷尼拉荧光素酶成像后10分钟，使用胰岛素注射器将适当体积的D-荧光素注射到每只动物体内。D-荧光素注射10分钟后，将小鼠放入相机室，获取小鼠后体的几幅图像，以便从血管生成获取萤火虫荧光素酶信号。

在扁病毒转导后，超过99%的细胞为RFP阳性，两个转导细胞系之间观察到的细胞培养形态没有差异。随后，转导细胞的生物发光成像显示，两个细胞系都发出强度相似的强生物发光信号。将转导细胞系皮下注射到转基因肿瘤携带小鼠模型中后，可在同一动物中出现D-luciferin的情况下，通过萤火虫荧光酶信号评估血管生成引起的肿瘤生长。

在植入后7天，Ganciclovir给法导致4T1-RRT细胞死亡，导致这些细胞建立的肿瘤中的雷尼拉荧光素酶信号显著减少。萤火虫荧光酶信号也随着雷尼拉荧光酶表达的增加而增加，在荧光素酶下降后减少。综合起来，这些结果表明，肿瘤血管生成和肿瘤生长之间有直接的关系。

事实上，甘西洛维诱导的肿瘤细胞死亡可能导致肿瘤血管生成抑制。此外，作为血管生成标志的抗血管内皮生长因子受体II的免疫保持揭示了4T1-RR肿瘤组织部分比4T1-RRT肿瘤部分更显著建立的微血管结构，这与甘西洛维尔施用后观察到的萤火虫百合酶信号的下降一致。该协议最关键的步骤是使用两种荧光素酶，如FLuc和RLuc同时跟踪细胞和血管生成。

该技术可用于治疗不同地点的癌细胞，并可广泛应用于病毒癌模型。这种小鼠模型允许将HSV-ttk/GCV跟踪系统的肿瘤生长和抗肿瘤效应动态地在活的动物中可视化。需要生物安全II级设施来防止扁病毒转染，因为介质中含有可能对人类有害的扁病毒颗粒。