细胞内病原体的突变库筛选和转录研究可以帮助回答有关在宿主体内生存的病原体的基因组和调控适应的关键问题。这些技术的主要优点是，它们是大规模调查技术，并且提供了对细胞内寿命适应的客观洞察。这些技术的影响延伸到与这种疾病关联的分枝杆菌脓肿的治疗，通过深入了解疫苗治疗的潜在目标。
首先在室温下75平方厘米组织培养瓶中培养30毫升Pepton酵母葡萄糖培养基中的阿米巴阿坎塔莫巴卡斯特拉尼或Ac。一小时后，使用25毫升移液器去除上流液，用10毫升的交流缓冲液洗三次，每次洗涤时不带碳或氮气。上次洗涤后，用一次剧烈的摇动将阿米巴从烧瓶底部分离，并调整猎鹰管中的细胞，在新鲜 Ac 缓冲液中每密耳集中五次 10 到五个阿米巴浓度。
种子五倍 10 到四阿米巴每井在 96 井板。将板在32摄氏度下放置一小时，不摇晃，让漂浮的阿米巴龙虫粘附在井上。同时，在冰上加热细菌，并在孵化结束时将解冻的细菌的5微升加入到每一个井中。
在 32 摄氏度下 1.5 小时后，将上经剂倒置在烟罩下消毒金属托盘中的无菌纱布上，将上经下一杯丢弃。每井用200微升的新鲜交流介质清洗每井三次。上次洗涤后，用20微升的新鲜培养剂孵育，每井辅以阿米卡辛，以消除任何剩余的细胞外分枝杆菌两小时。
接着是三次洗在新鲜的Ac介质，刚刚证明。然后，添加200微升的介质，并辅以新鲜的阿米卡辛到每一个井，然后添加5倍10到7热灭活大肠杆菌。48小时后，将每井10微升10%多西基硫酸钠的细胞在32摄氏度下，在32摄氏度下30分钟，并在含有5%羊血的哥伦比亚阿加盘子里传播5微升的碱酸盐。
通过在每滴上加入25微升无菌水，进一步稀释酸盐。当所有的落酸都镀上时，用塑料石蜡膜密封板，并在37摄氏度下孵育培养物三到四天。当菌落出现在板块上时，拍摄培养物，并识别细菌菌落数量最低的沉积物中受损的突变体，促进细胞内生长。
对于细胞内分枝杆菌RNA提取，首先在7H9介质中生长M.脓肿，并在120RPM下在50毫升管中补充甘油和葡萄糖至中指数阶段。在培养结束时，每次洗涤用10毫升的Ac缓冲液洗两次细菌，并测量O.D.600以估计细菌浓度。接下来，在8个分枝杆菌中加入8.5倍10，将6倍10添加到6个阿米巴的新鲜Ac介质中，在30摄氏度和80RPM下孵育一小时。
在孵化结束时，通过离心收获细胞，并在相同的离心机条件下，每次洗涤10毫升新鲜Ac缓冲液中洗涤三次。然后将细胞重新悬浮在10毫升新鲜Ac缓冲液中，辅以阿米卡辛，以消除任何细胞外细菌，并在30摄氏度和80RPM下孵育细胞4小时，然后在新鲜Ac缓冲液中洗两次。上次洗涤后，将受感染的阿米巴重新悬浮在四毫升的冷溶液三中，辅以 280 微升的β甲醇，以在冰上破坏阿米巴 10 分钟。
在孵育结束时，将细胞离心分离，对释放的细胞内细菌进行颗粒化，并在一毫升的冷溶液三中重新悬浮细菌颗粒。清除所有上一代，以避免被阿米巴RNA或可能制造样品的蛋白酶污染，这一点很重要。用第二个离心收集释放的细菌，并在一毫升的萃取缓冲液中重新悬浮颗粒。
然后在负80摄氏度下孵育24小时。将分枝杆溶液转移到两个毫升螺杆中，其中含有500微升梯度标记的硅珠，并在负80摄氏度下将管再储存24小时，以方便RNA合成活化和细胞溶解。分析当天，在冰上解冻样品，在6000 RPM下用两轮均质化细胞，25秒，随后在6000 RPM下进行一轮均质化20秒。
在每轮均质之间，在冰上冷却样品一分钟，以避免RNA降解。第三轮均质化后，在冰上冷却样品20分钟，并在每管中加入200微升在异丙醇中稀释的氯仿。涡流一分钟，然后离心样品，并在水相中加入0.8毫升的冷异丙醇，在负20摄氏度下孵育2至3小时。
在孵化结束时，再次离心样品，并在500微升的冷70%乙醇中清洗颗粒，无需混合。然后立即通过离心去除乙醇。吸制上一液，用于在离心浓缩器中干燥颗粒，并在 100 微升脱氧核糖核酸/无RNA水中重新悬浮颗粒。
分枝杆菌 MRNA 提取如所证明的，允许通过根据基因在响应其营养和矿物质来源有限的环境或低氧或酸性环境方面的角色对诱导和抑制基因家族进行分组，对诱导和抑制基因家族进行评估。在抗氧化和亚硝化应激，或在表达毒性因素的反应环境阿米巴。在尝试这些程序时，重要的是要记住同时对受控和受感染样品进行培养和RNA分离，以避免批量效应。
按照这个程序，其他方法，如双RNA测序可以预先形成，以回答有关宿主病原体相互作用的其他问题。开发后，该技术为微生物学领域的研究人员在阿米巴宿主模型中实现分枝杆菌毒性铺平了道路。不要忘记，使用阿米巴可能非常危险，因为如果您不按照程序中描述的步骤操作，阿米巴可能会变成囊肿。
