我们的协议为识别和鉴定维持HIV-1感染周期的病毒、核和非核宿主因子提供了替代方法。这种方法使用的概念适用于需要对未研究途径进行表征的其他病毒和疾病模型。介绍了用于修改其他蛋白质模型的故障排除技术。
展示这个程序的将是希望之城贝克曼研究所分子和细胞生物学部的科学家李海堂和Pritsana Chomchan，以及希望之城蛋白质组学核心和分子免疫学系成员的罗杰·摩尔。首先，在三个100毫米培养板中稳定地表达HLfB细胞系培养，以每毫升密度的2倍到10至6个细胞。当细胞达到适当的浓度时，在15毫升管中混合20微克含有Rev核定位信号的质粒，与15毫升管中1.76毫升TE 79/10的TE 79/10突变，然后加入240微升的两摩尔氯化钙，进行彻底的混合。
接下来，将管内的东西滴入一个新的15毫升管，含有两毫升的2x HBS，然后混合在涡流机上。在室温下30分钟后，旋涡降水。将悬浮液滴到三个 100 毫米的 HLfB 培养板中每个板上添加一毫升，同时轻轻旋转介质。
在细胞培养箱中孵育6小时后，用10毫升新鲜培养培养物取代转染混合物，将细胞返回孵化器42小时。转染48小时后，将每个盘子放在生物危害二级组织培养罩内的冰床上。取出细胞培养基，用10毫升预冷PBS轻轻冲洗细胞，而不会破坏细胞层。
冲洗细胞后丢弃 PBS。接下来，每盘用一毫升的解液缓冲液，辅以蛋白酶抑制剂鸡尾酒来治疗细胞。倾斜板将细胞聚集到池中，使用单元格刮刀手动破坏图层。
使用1000微升微管，将每个板的落酸放入一个15毫升的预冷管中，在冰上孵育15分钟，每5分钟进行一次涡旋。在孵育结束时，将酸盐分成三个1.5毫升的微离心管，通过离心收集酸盐。将上清液转移到新的15毫升管中，获得病毒蛋白酸盐浓度，如手稿中所述。
对于Rev核定位信号三质标志的共生沉淀，每次洗涤用500微升新鲜解合缓冲液，补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒，三次冲洗25微升M2亲和凝胶珠。在冷室或冰上使用试剂执行这些步骤。最后一次冲洗后，在五毫升的解解缓冲液的最后体积中，将每毫升病毒蛋白解酸的1毫克浓度加入冲洗珠。
在四摄氏度下旋转，孵育反应三小时。在孵育结束时，通过离心将病毒蛋白分解结成珠子颗粒。收集上清液，测量免疫后沉淀的细胞蛋白浓度。
有关样品存储说明，请参阅手稿。将750微升的解液缓冲液加入病毒蛋白解结珠颗粒中，将珠子转移到1.5毫升微离心管中，并在4摄氏度的旋转器上清洗珠子5分钟。如刚刚演示，通过离心收集珠子，在旋转器上再洗两次。
最后一次洗涤后，使用捏的、长的凝胶加载尖端，从珠子-共性沉淀物中去除任何解液缓冲液的痕迹。将珠子重新在 55 微升 2 倍加载缓冲器中。然后，在95摄氏度下将样品煮沸10分钟。
将 25 微升的 Eluate 加载到一个西侧印迹凝胶和一个库马西染色 SDS-PAGE 凝胶上。完成SDS-PAGE凝胶电泳后，在25毫升超纯水中冲洗凝胶三次，15分钟。上次洗涤后，在凝胶上加入100毫升的库马西染色试剂。
有关完整的染色协议，请参阅手稿。为了消化凝胶带，首先使用干净的剃须刀刀片将凝胶带从凝胶的整个通道（代表每个突变）切成大约五毫米的立方体。将每个带子放在一个干净的 0.5 毫升微离心管中。
在室温下用100毫摩尔碳酸氢铵覆盖带子两次，每次洗涤15分钟。然后，在真空离心机中干燥凝胶片五分钟。为了减少蛋白质，在100毫摩尔碳酸氢铵中用10毫摩尔二甲酰胺覆盖干凝胶片，在56摄氏度下孵育一小时，然后在水中用100毫摩尔多乙酰胺进行烷基化，在黑暗中室温下在水中燃烧一小时。
接下来，收缩和重新垫凝胶片两次与乙酮，其次是100毫升碳酸氢铵，两者都在室温下轻轻摇动15分钟。第二次再垫后，在真空离心机中干燥凝胶片五分钟。在100毫摩尔碳酸氢铵中，每微升50毫微克的凝胶片中，用50毫微克。
五分钟后，用100毫摩尔碳酸氢铵覆盖凝胶片，让它们完全重新井，添加额外的100毫摩尔碳酸氢铵，使肿胀的凝胶片完全覆盖。然后，在37摄氏度下孵育凝胶片，第二天早上停止反应，将1/10的样品体积与10%的甲酸在水中产生反应，然后从每个管中收集上流液。在含有不同浓度的氯化钠的三种不同的解解缓冲条件下，可检测出三极核定位信号三极标志。
B23在含有低盐浓度的解液缓冲液中也可检测，在含有中等盐浓度的解液缓冲液中几乎检测不到，在含有高盐浓度的解液缓冲液中检测不到。B23 检测在含有低氯化钠浓度的解液缓冲液中，具有野生型 Rev 三极旗，与 Rev 核定位信号 M1 三极旗失去亲和力。B23 与野生型 Rev 三极旗的亲和力也随着盐浓度的升高而降低，并且 PCDNA 阴性对照在两种解解缓冲条件下免疫沉淀后不产生非特异性免疫检测。
在2倍样品加载缓冲液中煮沸后，可检测出复核定位信号三等信号，而B23在37摄氏度和95摄氏度的样品缓冲液孵化条件下可检测。免疫沉淀和银染色后，如证明，野生型 Rev 和 Rev 核定位信号 M2、M6 和 M9 可检测为 18 千吨。在37千代顿标记物上也观察到与B23蛋白对应的波段。
使用 Coomassie 试剂进行染色进一步表明，在 18 千度（18 千吨）存在且不存在突变的情况下，Rev 核定位信号三极标志的可检测性。在潜在结合因素的故障排除和筛选过程中，对与疾病模型相关的参考使用尽可能多的正向和负控制。所有删除和单点突变可以通过与野生型 Rev 进行多样化来检查显性阴性活性，并用于逮捕 HIV-1 复制。
