单液滴数字聚合酶链反应对热点地区突变的综合和同步检测

该方法可作为癌症诊断工具，分析循环肿瘤DNA。该技术在单个反应中对聚类突变区域的多重基因变化进行检测。这有助于保存珍贵的患者样本。

该方法可以深入了解肿瘤的突变性特征。现在，它也可以应用于分子分析，作为qPCR的替代品，以获得核酸靶序列的绝对定量。在七毫升EDTA管中收集血液样本。

建议使用两根管子收集大约四毫升的血浆。在抽血后三小时内将血液样本在重力820倍的离心10分钟，分离出红血球、白血球和血浆。采样和离心之间的时间对于获得高品位的T细胞无DNA不受白血球释放的DNA污染至关重要。

离心后，使用血清移液器收集上清液，而不接触白细胞层。大约两毫升的血浆通常回收每个EDTA管。将塑料块转移到两根毫升管后，在16，000倍重力下将等分物离心，在15摄氏度下10分钟，以清除细胞碎片。

小心地收集等离子体，而不干扰颗粒，并转移到两毫升低温管。储存在负80摄氏度，直到需要。首先在50毫升管中加入400微升的蛋白酶K。

然后，从提取试剂盒中加入四毫升血浆和3.2毫升的ACL解液缓冲液，其中含有一微克的载体RNA。关闭管子，通过涡流混合30秒，以获得均匀溶液。然后，在60摄氏度下孵育30分钟。

孵育后，在碱酸盐中加入7.2毫升缓冲ACB，以优化循环核酸与二氧化硅膜的结合。通过涡流混合15至30秒。然后，在冰上孵化管子五分钟。

将柱和 20 毫升扩展器连接到真空泵上。关闭未使用的部分，以允许吸尘。短暂离心管后，小心地将混合物引入管延长器。

然后打开真空泵，让乳酸盐完全穿过柱子。拆下并丢弃管延长器。接下来，将 600 微升缓冲区 ACW1 应用于列。

当缓冲器 ACW1 通过柱中抽出时，添加 750 微升的 ACW2 缓冲液，最后加入 750 微升的 96 至 100% 乙醇。然后，将柱子放在一个干净的两毫升收集管中，以全速离心三分钟，以消除乙醇。将柱放入新的两毫升收集管后，打开盖子，然后在 56 摄氏度下孵育 10 分钟，使膜完全干燥。

孵育后，将柱放入干净的1.5毫升低结合管中。小心地使用 36 微升无 RNase 水，含 0.04% 的阿齐德钠。然后，合上盖子，在室温下孵育三分钟。

再次全速离心一分钟，以分离核酸。然后，储存在负20摄氏度，直到需要。首先在干净的 PCR 罩中解冻和平衡反应部件与室温。

然后在 RNase 和 Dnase 无蒸馏水中准备 20 倍的底剂和探针，每个底原以 18 微摩尔浓度，每个探针在 5 微摩尔浓度下。对于所有单独的 PCR 反应，通过组合 10 微升 2 倍 ddPCR Supermix、20 倍底和探针混合的 1 微升以及 20 微升蒸馏水中多达 10 微克的 DNA 样本来制备样本混合。彻底涡流混合物，确保均匀性。

并短暂离心收集管底的内装物，然后点胶。将 ddPCR 墨盒插入支架，并将 20 微升样品反应混合物加载到墨盒的中间孔中，用于液滴生成。在井底加入70微升液滴发生器油。

将带垫片的墨盒插入液滴发生器中。液滴将在墨盒的顶部井中产生。慢慢地轻轻地从墨盒中吸入 40 微升液滴，然后放入 96 井 PCR 板中。

在转移液滴后，使用板密封器立即用铝箔密封最终的 PCR 板，以避免蒸发。简要地将板离心，以收集井底的内装物。在热循环器上运行传统的 PCR 放大。

运行完成后，短暂离心板以收集井底的内装物。PCR 放大后，使用液滴读取器按照制造商的说明计算 PCR 正液和 PCR 负滴。以下是在放置 ddPCR 测定的优化步骤中获得的代表性结果。

此图显示了在含有100%突变DNA、5%突变DNA和100%野生型DNA的反应中检测突变DNA和野生型DNA。此图显示了使用 KRAS 和 EGFR 落点 ddPCR 测定分析的血浆样本示例，显示在 KRAS 的 exon 二中检测单核苷酸和多个替代物，并在 EGFR exon 19 中删除。在尝试此过程时，在每一步中必须小心操作，特别注意液滴生成，这是此方法的关键步骤。

该技术开发后，为癌症研究领域的研究人员和临床医生利用液体活检优化肿瘤突变分析铺平了道路。