此方法的总体目标是生成一个高度组织特异性靶向表达系统。在这种方法中，我们演示了针对我们的果蝇FGF同源，无分支的二进制转录驱动程序的生成。无分支的动态、时空表达调节气管气道上皮的分支血性。
虽然这种方法可以提供洞察无分支产生细胞的时空表达和迁移，但它可以很容易地应用于果蝇或其他模型生物体中的其他基因和组织，如C.Elegans和斑马鱼。该技术的主要优点是，它产生表达系统，是高度可靠的，组织和基因特异性，并仅在细胞中活性被替换基因的cis调控元素是功能。二元转录系统是靶向基因表达和操作的基本工具。
在基因的 cis 调控元素的控制之下表达的转活化剂，如 GAL4 或 LexA，驱动特定转录结合位点下游的效应器转基因，如 GAL4 的 UAS 和/或 LexO 的 LexO。这种方法用转录驱动器取代了无分支基因的第一个编码 exon。基于CRISPR Cas9的方法将LexA转活器序列在无分支基因的内源调控下，因此，促进在无分支特定的时空模式中专门进行转活化表达。
首先选择两个专门针对选定感兴趣区域两端的引导RNA靶点。打开您选择的 CRISPR 设计工具。此处使用飞 CRISPR 最佳目标查找器。
点击选择基因组'插入感兴趣的序列，并选择最近上传的果蝇黑色素体基因组注释，目前R下划线六，在下拉菜单。接下来，单击"选择导距长度"并输入 20。选择"所有CRISPR目标"，然后单击"查找CRISPR目标"。
通过为字符串设置最大值和仅为 PAM 设置 NGG 来评估所有候选引导 RNA 目标。为了生成串联导导RNA表达载体，首先PCR放大DNA片段，将两个原生空间序列引入pCFD4RNA表达载体骨干。使用正向和反向底法，每个底法具有原分空间序列，并使用高保真聚合酶和 pCFD4 模板 DNA 与 PCR 中的 pCFD4 矢量序列重叠。
要准备用于克隆的pCFD4，请用Bbs1酶消化质粒。在适当的消化缓冲液中设置反应，其中含有2至5微克的pCFD4质粒和一个微升Bbs1酶和50微升的最终体积。通过轻敲管子，通过短暂旋转收集从管壁到底部的所有散落液滴，混合反应内容物。
在运行PCR产品后，在37摄氏度下孵育反应混合物两小时，并在1%的阿加罗斯凝胶上消化质粒。使用标准凝胶纯化柱净化 6.4 千基对线性质粒和 600 基对 PCR 产品。根据制造商的协议设置DNA组装反应。
对于 GAL4 或 LexA 序列的基因组敲击，设计一个包含转活化序列的双链 HDR 供体，侧翼为两个同源臂。为了避免将导向RNA重新定位到工程位点，设计替代捐赠者的方式，使引导RNA识别位点被引入的外源序列打乱。此外，为了避免改变 cis 调节元素的纯度，请始终选择编码 exon 区域内的引导 RNA 识别位点。
要生成替换盒，请规划 DNA 组装策略，将四个部分连接在一起。五等和三原源同源臂、中外源性转活化DNA序列和线性克隆载体骨干。PCR 从适当的载体放大 GAL4 或 LexA 表达盒，PCR 从选择注射的母飞行线中提取的基因组 DNA 放大同源臂。
在每个 PCR 中使用高保真聚合酶生成目标片段。要设置DNA组装反应，请按照制造商的说明，将PCR克隆产生的线性克隆载体和目标片段与DNA组装母体混合和最终反应体积混合到20微升。在50摄氏度下孵育反应混合物一小时。
当Nos-Cas9胚胎以前注射了引导RNA表达质粒和替代捐赠者，发育成成人，交叉G0苍蝇单独平衡你的苍蝇从适合目标等位基因的线。在二氧化碳垫上对每个 G0 十字架上的 F1 后代进行麻醉。在立体显微镜下随机挑选10至20名男性。
从适合目标等位基因的行中单独将每个选定的雄叉到平衡器女性。当 F2 幼虫孵化时，从每个十字架上挑选 F1 父亲。通过用移液器尖端挤压每只苍蝇 10 到 15 秒来提取基因组 DNA，其中包含 50 微升的压扁缓冲液，而无需分配缓冲液。
然后，将剩余的缓冲液放入管中混合。在37摄氏度下孵育20至30分钟。孵育后，将管子放在95摄氏度的热块中一至两分钟，以灭活蛋白酶K.在旋转5分钟后，在10，000次G下旋转5分钟，将制备物储存在4摄氏度，用于进一步PCR分析。
使用前向一个应用，执行基于 PCR 的三步屏幕，然后反转一个以筛选是否存在插入或替换。使用正向 2 执行 PCR 并反转两个底转，以验证从三个主要区域插入或替换。使用底转 M13F 执行 PCR，并反转三个以检查末端'HDR。
使用已确认的结束 HDR 保持飞行线，并建立 F2 代的平衡库存。平衡器再次穿过，以去除其他染色体上任何意外的突变。无分支，或bnl表达，在这里显示红色在第三星幼虫翼盘，与受体喘不过气来表达细胞，以绿色显示，在生长的空气囊原。
无分支表达细胞如图所示在 TR5 横向连接分支和 TR2 后分支中。无呼吸的表达气管细胞在这里显示为绿色。无呼吸表达细胞以绿色显示，标志着从第九阶段到第14阶段的胚胎气管发育，无分支表达细胞以红色显示。
此图显示了在缺氧条件下，相对于控制而言，在异位组织位置诱导的无分支表达。该方法旨在保留无分支基因转录的所有原始时空规则。因此，必须用LexA转活化器编码序列替换该基因的第一个编码exon。
经过开发，这种新的基因工具集为探索无分支基因的新组织表达模式铺平了道路。它还使基因表达错误，并完全在无分支表达细胞中击倒，并有助于监测细胞的线性迁移和信号相互作用。
