解冻、培养和冷冻保存的嗜酸性粒细胞系

这些协议将帮助任何研究人员整合使用果蝇细胞系来驱动或补充他们的研究议程。大多数（如果不是所有的果蝇细胞培养）在按照这些指南处理时，会恢复、增殖和冷冻保存良好。用 70% 乙醇擦拭层流罩的工作表面后，将 5 毫升的适当介质分配到 25 厘米方的 T-flask 中。

用70%乙醇擦拭冷冻细胞系的容器，小心松开并解开盖子。使用巴斯德移液器，将一毫升室温介质从烧瓶转移到冷冻瓶中，轻轻混合以解冻冷冻细胞。注意细胞悬浮液不会溢出，将解冻细胞悬浮液的整个体积转移到烧瓶中，然后用新鲜的介质冲洗冷冻瓶。

让细胞在摄氏25度的培养箱中至少稳定到烧瓶底部两小时。不要将已包装的冷冻细胞返回零下80摄氏度的冷冻室，或返回液氮中。相反，尽快解冻细胞。

在光显微镜下确认附件后，用五毫升新鲜介质轻轻更换上清液，然后再将烧瓶返回孵化器。或者，解冻后，将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管中进行离心，并在5毫升新鲜介质中重新悬浮颗粒，然后播种到T-25烧瓶中，正如刚刚演示的。要确定细胞是否准备好通过，在显微镜下检查培养的形态和汇合。

考虑到细胞密度和倍增时间，最后一次细胞被分培养，以及培养物中微生物污染的任何迹象。如果培养物出现高度汇合，则使用培养物的十毫升上清液轻轻地将细胞从培养板底部分离，通过计算由此产生的单细胞悬浮液中可行的细胞数量来确定细胞密度。如果细胞密度在适当介质中每毫升的五到十倍到六千分之六的细胞之间，将细胞分培养。

在一个新的培养板中，每毫升浓度至少加入十倍至六个细胞，以达到所需的播种细胞密度。然后用操作者首字母缩写、日期、分割比、种子细胞密度、细胞系标识符、介质、通道编号以及抗生素等任何介质添加物覆盖并标记板，并放入塑料容器中，在 25 摄氏度的培养箱中继续孵化。要将粘附细胞从100毫米培养皿底部分离出来，首先将所有上清液转移到无菌烧瓶中，然后缓慢地加入一毫升0.05%的三丁鱼EDTA冲洗细胞。

轻轻旋转，以确保 trypsin 溶液在丢弃溶液之前覆盖整个生长表面。接下来，轻轻将一至两毫升新鲜0.05%的尝试性EDTA加入到盘子中，并将盘子放在25摄氏度的培养箱中3至10分钟。当可以观察到细胞层分离和滑离生长表面时，停止三辛活性，加入保存的上清液的九毫升，并彻底混合细胞悬浮液，分离细胞团块。

当所有细胞被脱落时，生长的表面将会清晰。要使用 Neubauer 细胞计数幻灯片手动计数细胞，请先擦拭血细胞计幻灯片的表面，然后用 70% 酒精覆盖幻灯片。混合后，将15微升的细胞加入血细胞计的每个凹槽边缘，以填充两个腔室。

细胞悬浮液将通过毛细管作用被拉入计数室。使用 10 倍显微镜目标，在网格中间由平行线约束的网格中间的 1 毫米平方面积内计数 100 到 200 个细胞。然后用第二个腔室重复枚举，并使用两个计数的平均值根据公式确定细胞密度。

对于果蝇细胞系低温保存，在冷冻介质中重新悬浮细胞颗粒，最终细胞密度至少为每毫升第七细胞的四倍十倍。将适当体积的低温保护剂、二甲基硫化物或DMSO加入细胞悬浮液中，使最终的DMSO浓度为10%，轻轻混合细胞悬浮液。接下来，小心地将细胞悬浮液的0.5毫升等同加入预先标记的低温瓶中，并将低温瓶放入装满异丙醇的冷冻容器中。

然后在夜间将冷冻容器转移到零下80摄氏度的冰柜中，使低温瓶的温度慢慢降至冷冻温度。接下来，快速将低温小瓶转移到藤罐中，插入液氮罐中。或者，将冷冻冷冻瓶转移到预冷冷冻盒中，将冷冻冷冻瓶存放在氮气冷冻机的液相中。

细胞系的汇合可以通过光学显微镜确定。早期到达汇合的快速生长细胞系需要定期通过，每周最多两次。相比之下，生长缓慢的细胞至少每两周或更长时间通过一次，尽管这些细胞需要每周喂养一次新鲜的媒介。

来自不同组织源的细胞系在形态、粘附特性、介质要求和倍增倍数上有所不同。对于定量实验，细胞计数是必不可少的。可以使用血细胞计或自动粒子计数器计算细胞。

单元格汇合是有经验的操作员何时进行亚文化视觉指南。然而，细胞计数导致一个可预测的子培养时间表，并有助于检测生长异常。使用液氮时要小心，并使用适当的保护装置。