mub₄₀肽在中性炎症事件检测中的应用

MUB40是一种新型的嗜中性粒细胞标记物，与乳铁蛋白结合，允许在人类和所有哺乳动物组织样本中进行特定检测。使用 MUB40 标记嗜中性粒细胞是简单、快速和特定的。它现在在我们的实验室中被广泛使用，这种技术的含义延伸到炎症性疾病的诊断。

首先，根据文本协议准备解决方案一、二和三，并把它们放在一个厌氧的柜子中过夜。然后，将采集的血液管在650克下离心20分钟，将细胞从血浆分数分离。在不干扰分离的血液的情况下，将管转移到厌氧柜，然后将血浆分数转移到50毫升锥形管中。

在此之后，从厌氧柜中取出等离子体管，并在2900g下离心20分钟。注意不要破坏颗粒血小板，将管子转移到厌氧柜，将血小板劣质血浆移液到新鲜 50 毫升管中。使用血液采集管，将红血球组合在锥形50毫升管中。

然后，加入0.9%的氯化钠溶液，直到总体积达到44毫升，并加入6毫升6%的脱氧银糖。倒置管10至20次，轻轻混合血液和葡萄糖混合物，让管沉淀至少30分钟。当管沉积物时，通过向 5.8 毫升等离子体中加入 4.2 毫升的 Percoll 溶液来准备 Percoll 梯度，然后反转管以混合。

接下来，收集含有德xtran顶部部分的嗜中性粒细胞，注意不要移液红血球。拧紧螺钉盖，从厌氧柜中拆下离心管，并在 300 g 下离心管 10 分钟。注意不要干扰颗粒细胞，将管子放回厌氧柜中。

然后，通过移液去除液体。轻轻将颗粒重新在一毫升血浆中。缓慢地将重新暂停的细胞添加到 Percoll 溶液的顶部。

小心地从厌氧柜中取出 Percoll 溶液管，并在 800 g 下将其离心 20 分钟，以将 PBMC 与嗜中性粒细胞分离。接下来，根据文本协议准备14毫升的洗涤缓冲液。然后，将珀科尔管放在厌氧柜中。

使用移液器去除 Percoll 和 PBMC，并在一毫升洗涤缓冲液中重新暂停含有颗粒的中性粒。接下来，在重新悬浮的细胞中加入200微升磁珠。轻轻混合和孵育细胞和珠子至少15分钟。

在此之后，用两毫升的洗涤缓冲液洗两次分离柱。在柱下拿着一个新的15毫升锥形管时，缓慢移液通过柱状的中性粒细胞红细胞混合物。从柱流应为多云并失去红色，确认嗜中性粒细胞与剩余红血球的总分离。

将两毫升洗涤缓冲液添加到柱的顶部，并在同一管中收集流经。到此洗涤结束时，流经应清晰。轻轻混合收集管，确保嗜中性粒细胞均匀分布。

然后从细胞计数中收集10微升的流经。在此之后，从厌氧柜中取出中性粒细胞管，并在300克离心管20分钟。将沉淀的中性粒细胞放回厌氧柜，通过移液去除洗涤缓冲液。

然后，在等离子体中重新暂停颗粒。将一升 RI-MUB40-Cy5 加入一毫升 RPMI-1640 介质中，不带酚红色，通过移液混合。然后，添加一个微升的 FMLP 溶液和移液器混合。

将混合物转移到玻璃底显微镜盘中。然后向菜中加入适当体积的纯化细胞。最后，将盘子放入倒置荧光显微镜中，开始图像采集。

在此协议中，MUB40用于活细胞，在使用 FMLP 进行模拟时检测嗜中性粒细胞分泌物。颗粒含量（包括乳铁蛋白）释放的动力学可以随着时间的推移而可视化，这里用品红色显示。MUB40 可额外用于固定嗜中性粒细胞。

在这里，在一个时数序列中吞噬荧光珠。中性粒的内容被标为蓝色。中性粒细胞在早期点很少或没有细胞染色，并且逐渐，RI-MUB40标签随着时间的推移而增加，在等离子膜和珠表面。

MUB40也可用于固定炎症组织，以检测嗜中性粒细胞，如文本数字所示。我们在这里描述中性粒细胞纯化程序，在我们的实验室中常规应用。任何其他方法都适用，MUB40-Cy5 标签仍将有效。

中性粒细胞在纯化后可专门用MUB40标记，或直接在患者或动物模型中的发炎组织中。若干MUB40衍生工具被设计成扩大其用途。该技术开发后，为炎症领域的研究人员探索炎症性疾病的嗜中性粒细胞和活化铺平了道路。