非洲锥虫体是造成人类非洲锥虫病,或昏睡病和非洲动物锥虫病的责任人。引起昏睡病的锥虫体是采采蝇,这些寄生虫在撒哈拉以南非洲的许多地理病区存在。寄生虫的检测对于诊断、治疗和随从至关重要。
血清学可以给出假阳性和不幸的阴性结果。为了帮助血液的检测,必须集中锥体。各种寄生虫浓缩技术已被使用。
最敏感的方法是通过一列心安的血管交换器、DEAE纤维素分离出血液中的寄生虫,然后进行离心和微观观察。因此,DEAE纤维素法是最好的,并且至今是一种将寄生虫从血液中可视化和隔离的参考方法,用于人类非洲锥虫病的诊断,特别是在野外条件下。这种方法是非洲锥虫病的最合适诊断方法,也为免疫学、生物、生化、制药和分子生物学研究提供了纯化寄生虫。
所有调查均符合实验室动物护理和使用指南,并已获得法国当局的同意,使用的所有协议均已获得我们当地道德委员会的批准。根据书面协议称出每种物质。加入蒸馏水,用磷酸二氢钾精确调节至pH 8,制成以下缓冲溶液,浓缩磷酸盐缓冲液盐水2X。
加入蒸馏水和葡萄糖,用于磷酸盐缓冲盐水葡萄糖。对于100毫升的洗脱缓冲液,每毫升青霉素加入100个单位,每毫升链霉素100微克,向磷酸盐缓冲盐水葡萄糖添加5微克毫克的酚红色。100克DEAE纤维素首先用三升蒸馏水洗净,然后离开沉淀。
细颗粒被丢弃。洗涤重复,直到上清液是明确的。添加浓缩磷酸盐缓冲盐水2X,搅拌DEAE纤维素。
pH值调整为8,含磷酸钾。然后用蒸馏水洗两次纤维素,用磷酸盐缓冲盐水葡萄糖洗两次。DEAE纤维素和磷酸盐缓冲盐水葡萄糖以相等的体积混合。
合金在室温或四摄氏度或零下 20 摄氏度下四分之一分,以进行长时间储存。锥体感染的血液储存在液氮中。一毫升的合金夸脱在室温下解冻。
使用针头和一毫升注射器从冷冻管中仔细收集寄生虫。解冻寄生虫的可行性由感染前光显微镜观察所可视化的活力评估。寄生虫被注射到两只小鼠的内侧腔中,每只小鼠500微升。
感染后的每一天,寄生虫病都通过用针头从尾巴上收集一滴血,然后通过显微镜检查进行评估。当寄生虫病处于适当水平时,会采集受感染的血液。夹子或支架中支持 10 毫升注射器,并添加预切的滤纸。
准备好的DEAE纤维素倒入注射器,高达8或9毫升的水平。用洗脱缓冲器清洗列。两毫升受感染的血液被小心地放置在柱上,在50毫升离心管中收集在柱状水液中。
根据锥体体传递情况定期添加洗脱缓冲液。通过定期服用一滴列水化,并使用光显微镜观察锥形体,检查锥形体通过柱的传递。当不再在伊卢酸盐中观察到锥形体时,锥形管在1,800次G下离心,在4摄氏度下10分钟。
上清液被丢弃,托盘中的锥体用血细胞计计数。收集的锥体随后被稀释在计划调查所需的介质中。这种方法是非洲锥虫病最合适的诊断方法,为免疫学、生物、生化、制药和分子生物学研究提供了纯化寄生虫。
这些研究之所以得到发展,是因为DEAE纤维素纯化寄生虫很容易从自然或实验感染的宿主,特别是啮齿动物获得大量。通过微观观察评估药物制剂存在的锥度体生存能力。寄生虫的生存能力与运动性相关,因此,可以在光学显微镜下以 40 倍或更高的放大倍率进行眼睛检查。
寄生虫的生存能力通过测量动体形式的百分比进行评估。在模拟处理控制井时,将测试化合物的稀释添加到 96 孔组织培养板的每个孔中。每个浓度以三钙评估。
每次稀释的可行寄生虫数量与控制井中的寄生虫数量进行比较。本图显示了在非洲人类锥虫病治疗中使用的参考药物五溴二胺的影响。锥体巨噬细胞共培养允许在细胞水平上研究宿主寄生虫的相互作用。
在巨噬细胞寄生虫共培养中,额外的细胞锥体会诱导产生巨噬细胞精氨酸酶,水解精氨酸到食肉素。苯胺是多胺和苯丙酮的前体,对寄生虫的存活和生长至关重要。此外,精氨酸的耗竭减少了一氧化氮的产生。
随后,加入一种阿金酶抑制剂S-L-半胱氨酸,以联合培养,显著减少巨噬细胞诱导寄生虫的生长。阿吉娜斯诱导由锥体排泄和/或分泌因子进行调解。这种精氨酸诱导因子已被确定为奥辛基宁。
激酶结合到C型莱金曼尼诺斯结合受体。精氨酸酶被诱导并产生有利于寄生虫生长的食肉素。在巨噬细胞中,用12.5毫摩尔人或巨噬细胞培养的金氨酸不会诱发阿吉娜斯,而巨噬细胞的人类受体已被删除。
使用DAEA纤维素纯化锥体细胞生物学和生化实验的进一步实例在已识别出新的细胞骨骼蛋白(如BILBO1)的研究中得到证明。BILBO1 是重要细胞骨骼结构和寄生虫生存的生物发生所需的。因此,BILBO1 是致病性锥体干预的重要目标。
图中显示了一个显示血液培养形式的免疫浮游标记,用抗BILBO1抗体探测的锥形瘤布鲁西细胞。此外,葡萄糖和曲氨酸代谢已描述使用DEAE纤维素纯化锥体和参与这些过程的酶已经通过实验验证。图中显示了血液形成锥形体中葡萄糖和三元代谢的示意图。
通过心安的核酸交换从血液中纯化非洲锥虫体,DEAE纤维素柱最近有所改进,仍然是锥体检测的黄金标准,不仅在流行地区寄生虫病含量低的自然宿主,而且大量需要寄生虫进行实验研究。研究已经能够识别锥体分子在寄生虫的生存和生长中起着至关重要的作用。已确定的目标可能是未来疫苗的基础,这种疫苗具有对人类和动物的潜在抗原,采用一种健康方法。